人原代肝细胞与干细胞衍生肝细胞样细胞（HLCs）表征标准化方案

原代人肝细胞(PHH)是研究肝脏生物学与药物代谢的金标准，但存在体外易脱分化、来源依赖废弃供肝、批次差异大等局限。干细胞衍生肝细胞样细胞(HLCs)为解决这些问题提供了无限来源，但其质量评估缺乏统一标准。由伊朗、瑞典、英国、德国、比利时、美国等多国科研机构研究者组成的国际团队在《Journal of Cellular and Molecular Medicine》发表综述性方案：系统阐述 HLCs 的多维度表征方法(形态、分子、功能、体内移植)，以 24 小时培养的 PHH 为参照，明确从光学显微镜观察到 LC-MS/MS 代谢分析的完整流程，解决 HLCs 质量控制不统一的问题，为 HLCs 在药物研发、肝病模型构建及再生医学的应用提供标准化工具。

本研究旨在建立人 PHH 与干细胞衍生 HLCs 表征的标准化 protocol，确保 HLCs 质量可评估、结果可重复。方法：1. 从形态(光学 / 荧光显微镜、TEM)、分子(转录组 qRT-PCR / 单细胞 RNA-seq、蛋白组 WB / 流式)、功能(CYP 酶活性、尿素生成、ICG 摄取)多维度评估 HLCs;2. 以 24 小时培养的 PHH 为对照，验证 HLCs 成熟度;3. 通过小鼠体内移植(肾包膜下、脾脏等部位)验证 HLCs 体内功能。结果：明确 HLCs 成熟标志(如 ALB、CYP3A4 表达，ICG 摄取 / 释放能力)，建立 “形态 - 分子 - 功能 - 体内” 四层评估体系。结论：该方案可高效区分 HLCs 质量，为 HLCs 在基础研究与临床转化中的应用提供统一标准。

实验方法

1.材料准备：PHH 来源于移植废弃人肝，经胶原酶灌注分离;HLCs 由人 iPSC/ESC 经 “定型内胚层→肝祖细胞→成熟 HLCs” 三步诱导(基础培养基为 DMEM/F12+10% FBS，添加 FGF2、BMP4、HGF 等诱导因子);试剂包括肝特异性抗体(ALB、CYP3A4、HNF4α)、CYP 酶底物(7 - 乙氧基试卤灵)、ICG 染料、LC-MS/MS 检测试剂;仪器涵盖激光共聚焦显微镜、透射电镜(TEM)、流式细胞仪、Seahorse 线粒体功能分析仪、LC-MS/MS 系统，实验符合伦理规范。

2.形态与超微结构分析：光学显微镜观察 HLCs 多边形形态(成熟肝细胞特征)，荧光显微镜通过免疫染色(ALB 绿色、HNF4α 红色、DAPI 蓝色)定位肝特异性蛋白;TEM 分析亚细胞结构(线粒体、粗面内质网、胆小管样结构)，样本经戊二醛固定、环氧树脂包埋、超薄切片(<100nm)后成像，评估 HLCs 超微结构成熟度(如是否形成紧密连接与微绒毛)。

3.分子表征：转录组层面，通过 qRT-PCR 检测肝特异性基因(ALB、CYP3A4、HNF4α)与干细胞标志物(OCT4、SOX2)，RNA-seq 分析 HLCs 与 24h PHH 的基因表达差异，单细胞 RNA-seq 解析 HLCs 异质性;蛋白组层面，WB 检测 CYP 酶(CYP1A2、CYP2D6)与转运体(BSEP、MRP2)，流式细胞术定量 ALB + 细胞比例，免疫组化验证肝特异性蛋白定位(如 BSEP 在胆小管富集)。

4.功能评估与体内移植：功能 assay 包括 CYP 酶活性(EROD 法检测 CYP1A1 活性，LC-MS/MS 检测 CYP3A4 介导的咪达唑仑代谢)、尿素生成(比色法检测培养基尿素浓度)、ICG 摄取 / 释放(30 分钟摄取、2 小时释放，显微镜观察)、LDL 摄取(DiI 标记 LDL，荧光成像);体内移植将 HLCs(1×10⁶细胞 / 只)通过肾包膜下注射移植到 Fah⁻/⁻肝衰竭小鼠，移植后 1-4 周检测小鼠血清人 ALB 水平，免疫组化(WT1 染色)验证 HLCs 存活。

实验结果

图1：HLCs 分化的显微镜成像

该图展示人 iPSC 分化为 HLCs 的关键阶段：上方为相差显微镜图像，分化 0 天为 iPSC(圆形集落)，7 天为定型内胚层(梭形)，14 天为肝祖细胞(上皮样)，21 天为成熟 HLCs(多边形，含颗粒状胞质);下方为对应阶段的免疫荧光染色，iPSC 表达 SOX2(红色)，定型内胚层表达 SOX17(绿色)，肝祖细胞表达 HNF4α(红色)与 AFP(绿色)，成熟 HLCs 表达 ALB(绿色)与 HNF4α(红色)，DAPI(蓝色)标记细胞核。该图直观呈现 HLCs 分化过程中的形态与标志物变化，为分化阶段判断提供依据。

图2：HLCs 的 TEM 超微结构

该图为 21 天 3D 培养 HLCs 的 TEM 图像(比例尺 1μm)，从上到下依次标注关键结构：细胞核(N)及核仁(n)，胞质内丰富的线粒体(M)、高尔基体(G)、粗面内质网(箭头)、糖原颗粒(GR)，细胞间形成紧密连接(TJ)、缝隙连接(GJ)与黏附连接(FA)，细胞表面有微绒毛(MV)，底部可见胆小管样结构(BLC)。这些结构与成年肝细胞高度相似，证实 HLCs 具备成熟肝细胞的超微结构基础，可支持代谢与胆汁转运功能。

图3：肝细胞代谢通路示意图

该图从上到下展示肝脏解毒的三阶段通路：第一阶段(I 相代谢)标注 CYP450 酶家族(如 CYP1A1)催化氧化 / 还原反应，以 “7 - 乙氧基试卤灵→试卤灵” 为例;第二阶段(II 相代谢)标注 UGT、SULT 等酶介导葡萄糖醛酸化 / 硫酸化反应，增强底物水溶性;第三阶段(III 相代谢)标注 ABC 转运体(如 BSEP、MRP2)将代谢产物泵入胆汁;右侧补充核受体(AHR、PXR)对 CYP 酶的转录调控作用。该图明确 HLCs 功能评估的核心靶点，为 CYP 酶活性、转运体功能检测提供理论框架。

图4：CYP1A1 激活与 EROD assay 原理

该图上半部分为 AHR 受体激活机制：多环芳烃(PAHs)结合胞质 AHR，AHR 与 ARNT 形成复合物后入核，结合 AHRE 元件启动 CYP1A1 转录;下半部分为 EROD assay 流程：CYP1A1 催化 7 - 乙氧基试卤灵(7-ER，无色)脱乙基生成试卤灵(红色荧光)，通过荧光强度定量 CYP1A1 活性，标注反应底物、产物及检测仪器(荧光分光光度计)。该图阐明 CYP 酶活性检测的分子机制，为 HLCs 代谢功能评估提供标准化方法。

图5：HLCs 功能 assay 结果

该图按 “从上到下” 顺序展示四项关键功能检测：第一行 a 图为 DiI 标记 LDL 摄取(红色荧光)，DAPI(蓝色)，200× 放大，可见 HLCs 胞质内红色颗粒;第二行 b 图为 PAS 染色，HLCs 胞质内紫红色糖原颗粒;第三行 c 图为 ORO 染色，HLCs 内红色脂质滴;第四行 d 图左侧为 ICG 摄取(绿色胞质)，右侧为 ICG 释放(绿色消失)。四项 assay 均在分化 45 天的肝胆类器官中检测，比例尺 50μm，验证 HLCs 具备成熟肝细胞的核心代谢功能。

图6：HLCs 小鼠移植路线示意图

该图从上到下依次标注 HLCs 在小鼠体内的六种移植部位及特点：1. 肾包膜下(操作简单，便于术后观察细胞存活);2. 脾脏(通过门静脉引流至肝脏，利于肝内定植);3. 腹腔肠系膜(血管丰富，支持大量细胞存活);4. 皮下(临床相关移植部位，可容纳规模化培养的 HLCs);5. 大网膜(含免疫调节细胞，减少移植排斥);6. 颅骨窗(搭配活体成像，实时观察细胞 engraftment 动态);每个部位右侧标注适配的 HLCs 来源(iPSC/ESC/ 成人干细胞衍生)。该图为 HLCs 体内功能验证提供部位选择依据，指导不同研究目的的移植方案设计。

研究结论

本研究建立的人肝细胞表征方案具备多维度覆盖、对照明确、可操作性强及临床导向四大核心价值，从形态(TEM 超微结构)、分子(转录组 / 蛋白组)、功能(CYP 活性、ICG 转运)到体内(小鼠移植)形成四层评估体系，以 24 小时培养的 PHH 为 “金标准参照” 避免 HLCs 成熟度误判，同时提供具体试剂与仪器参数便于不同实验室重复，体内移植部位还涵盖临床相关的皮下、大网膜以支撑 HLCs 临床转化;该方案填补了 HLCs 标准化表征的缺口，可推动 HLCs 在药物肝毒性筛选(如 CYP 介导的药物相互作用)、遗传性肝病模型(如 α1 - 抗胰蛋白酶缺乏症)、再生医学(如肝衰竭细胞治疗)中的应用，为肝脏研究提供统一技术框架。