猪与啮齿类支持细胞（SCs）分离及移植标准化方案

支持细胞(SCs)是生精小管关键体细胞，兼具生殖支持与免疫调节功能，在生殖研究、再生医学中价值显著。美国德克萨斯理工大学团队在《Methods in Molecular Biology》(2025, 2954:163-182)发表方案：详述新生猪、青春期小鼠/大鼠SCs分离、培养及小鼠肾包膜下移植流程，解决多物种 SCs 方案不统一问题，为相关研究提供可靠工具。

本研究旨在建立猪与啮齿类SCs分离、培养及移植的标准化protocol。方法：新生猪/小鼠/大鼠睾丸经酶解(胶原酶 + 胰酶)、纯化获取 SCs，培养为聚集体后移植到小鼠肾包膜下，WT1 免疫组化验证存活。结果：猪每睾丸获 20-30 万 SCs，小鼠每睾丸获 1 万 SCs，纯度>90%，移植后存活≥8天。结论：方案高效可重复，适用于生殖生物学与再生医学研究。

研究背景

SCs核心功能包括构建血睾屏障、调控精子发生、分泌 TGF-β/IDO 构建免疫耐受微环境，近年在糖尿病/神经疾病移植、男性避孕中应用潜力大。但不同物种 SCs 分离方案差异大，缺乏统一标准，导致实验重复性低。本研究针对新生猪与青春期啮齿类，建立标准化流程，填补技术缺口。

实验方法

1.材料准备：供体为 1-5 天新生猪、19-22 天 C57BL/6 小鼠、18 天 Lewis 大鼠，受体为 6-8 周龄 BALB/c 小鼠;试剂含解离液(pH7.4)、HBSS/DMEM/Ham’s F10 培养基、胶原酶 V(1mg/mL)、胰酶(1mg/mL)、DNase I(400U/mL);设备包括摇床水浴锅、离心机(308×g/860×g)、显微操作仪等，均符合伦理与无菌规范。

2.新生猪 SCs 分离：睾丸经 70% 乙醇清洗、冷 HBSS 冰浴后，去除鞘膜与附睾，切碎为 0.5-1mm³ 小块;加 25mL 胶原酶 37℃摇床(90RPM)消化 10 分钟，HBSS 终止后 308×g 离心清洗;加解离液重悬，加胰酶 + DNase I 再消化 10 分钟，500μm 滤网过滤纯化，计数后按需求培养为聚集体(Ham’s F10+10% FCS)或单层(DMEM+10% FCS)。

3.小鼠 / 大鼠 SCs 分离：动物麻醉后腹腔切口获取睾丸，20 只小鼠睾丸 / 管，加 25mL 胶原酶 37℃消化 7 分钟，后续胰酶处理、过滤纯化步骤同猪 SCs，培养方式一致，仅酶解时间适配啮齿类睾丸特性。

4.SCs 移植流程：培养 48 小时的 SCs 聚集体离心浓缩，用 PE-50 导管吸入并 Liga 夹封口;受体小鼠麻醉后左侧腹部切口暴露左肾，27G 针头划开肾包膜，硅化玻璃探针挑出间隙，注入 SCs pellet 后烧灼封口，缝合肌肉与皮肤，术后注射丁丙诺啡护理，1-8 天取肾用 WT1 免疫组化验证存活。

实验结果

Fig1：新生猪睾丸处理与切碎

该图展示新生猪睾丸分离关键步骤：左图为去除睾丸鞘膜与附睾的操作，中图为去包膜后的睾丸实质，右图为用无菌钝头剪刀将睾丸切碎为 0.5-1mm³ 小块(置于冷 HBSS 中)，切碎过程约 10 分钟，确保组织块可通过 10mL 移液管，为后续均匀酶解奠定基础。

Fig2-3：新生猪 SCs 酶解过程观察

Fig2 呈现胶原酶消化 6 分钟时生精小管开始分离，10 分钟时小管完全脱离间质，胰酶消化 10 分钟后出现单细胞;Fig3 对比消化前束状生精小管、胶原酶消化 5 分钟后松散小管及胰酶消化 10 分钟后的单细胞悬液(20× 放大)，明确两步酶解的最优时长，避免消化不足或过度损伤细胞。

Fig4：SCs 过滤纯化

该图展示用 500μm 无菌滤网纯化 SCs 的操作：先将滤网固定于过滤架并密封，再将酶解后的细胞悬液通过滤网，去除未消化组织与 DNA 团块，确保收集的单细胞悬液纯度，为后续培养减少杂质干扰。

Fig5：啮齿类动物睾丸收集

该图记录小鼠 / 大鼠睾丸获取流程：左图为麻醉后腹腔垂直切口(从盆腔到胸骨)，中图为将睾丸转移至含冷 HBSS 的离心管(20 只小鼠睾丸 / 管)，右图为将睾丸切碎为 1mm³ 小块，操作适配啮齿类睾丸体积小的特点，确保与猪 SCs 分离流程的可对比性。

Fig6：SCs 培养形态

该图显示不同物种 SCs 的培养形态：小鼠 SCs 在非组织培养板形成聚集体(移植用)，新生猪 SCs 聚集体结构紧密，小鼠聚集体石蜡切片 H&E 染色可见细胞密集，新生猪 SCs 在组织培养板形成单层贴壁细胞，证实 SCs 可按实验需求灵活培养。

Fig7-8：移植前 SCs 准备

Fig7 为 1.5mL 离心管开盖置于培养箱，让 SCs 聚集体自然沉降;Fig8 展示用显微操作仪将 SCs pellet 吸入 PE-50 导管，Liga 夹封口后固定于离心机，离心 5-10 分钟形成致密 pellet，确保移植时细胞浓度适宜，减少液体体积对肾包膜间隙的压力。

Fig9-11：小鼠肾包膜下移植步骤

Fig9 完整呈现移植操作：拉出肾脏、27G 针头划开包膜、硅化玻璃探针挑出间隙、注入 SCs、烧灼封口、缝合肌肉与皮肤;Fig10 为硅化玻璃探针特写，其光滑表面避免包膜损伤;Fig11 展示移植操作台布局(显微操作仪 + 含 SCs 的导管)，保证操作精准无菌。

Fig12：移植后 SCs 存活验证

该图为移植后检测结果：左图为移植 1 天的新生猪 SCs 移植物(肾包膜下白色团块)，右图为移植 8 天的小鼠 SCs 移植物，WT1 免疫组化(深棕色箭头)证实 SCs 存活，验证移植流程的可靠性与 SCs 的体内存活能力。

研究结论

本方案核心优势：1. 覆盖新生猪与青春期小鼠 / 大鼠，统一多物种 SCs 分离参数;2. SCs 可灵活培养为聚集体(移植)或单层(体外实验)，移植后存活≥8 天;3. 明确关键步骤(酶解时间、过滤孔径、离心转速)，重复性高。该方案为 SCs 在生殖研究、再生医学中的应用提供标准化工具，推动异种移植与基因工程 SCs 研究发展。