老年小鼠小胶质细胞原代培养方法：为衰老神经生物学研究提供新型工具

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的固有免疫细胞，老年小胶质细胞存在 “炎症衰老” 特征，与阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关。但传统小胶质细胞培养多依赖新生或年轻小鼠，无法模拟老年细胞特性。美国北卡罗来纳大学夏洛特分校 Kristen E. Funk 团队在《Current Protocols》(2025, 5:e70199)发表优化方案：以 18 月龄老年 C57BL/6J 小鼠皮层为材料，通过胶原酶消化 + Percoll 梯度纯化，在含 GM-CSF 的培养基中成功培养小胶质细胞，可维持 30 天且保留老年细胞激活特征，为衰老神经生物学及神经退行性疾病研究提供关键模型。

本研究旨在建立可靠的老年小鼠小胶质细胞原代培养方法，解决传统模型的局限。方法：1. 取 8 周成年与 18 月龄老年小鼠皮层，经心脏灌流、解剖分离后，用胶原酶消化 + 机械研磨处理;2. Percoll 梯度离心纯化小胶质细胞，接种于 PDL 包被的非组织培养板，用含 GM-CSF 的培养基培养;3. 免疫荧光(Iba1/TMEM119)与流式细胞术(CD45/CD11b/P2RY12)鉴定纯度及激活状态。结果：每只小鼠可获～1×10⁶ viable 细胞，纯度 > 95%，可培养 30 天，老年小胶质细胞 MHC I/II、CD68 等激活标志物水平显著高于成年细胞。结论：该方案可高效制备老年小胶质细胞，为研究衰老相关小胶质细胞功能提供可靠工具。

研究背景

小胶质细胞作为 CNS 的固有巨噬细胞，参与神经发育、突触重塑及损伤修复，在衰老过程中会出现 “炎症衰老”—— 基础炎症水平升高、吞噬功能下降，且激活标志物(CD45、MHC II)表达增加，这与阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发病密切相关。传统小胶质细胞培养多采用新生或年轻小鼠，虽易培养但无法复现老年细胞的病理特征;而老年小鼠小胶质细胞因分离难度大、存活依赖特定因子(如 GM-CSF)，可靠培养方案稀缺。现有研究表明 18 月龄小鼠相当于人类～60 岁，是研究衰老相关神经疾病的理想模型，因此亟需建立老年小鼠小胶质细胞培养方法，填补衰老神经生物学研究的模型缺口。

实验方法

1.细胞模型与材料准备：采用 8 周龄成年与 18 月龄老年 C57BL/6J 小鼠(符合 IACUC 伦理规范)，培养板用 10μg/ml PDL(硼酸盐缓冲液配制)包被≥1 小时，晾干备用;制备专用培养基(微胶质细胞生长培养基：DMEM/F12+10% FBS+1% 抗真菌抗生素;加 GM-CSF 至终浓度 5ng/ml 用于老年细胞培养)，胶原酶消化缓冲液(含胶原酶 D、TLCK、DNase I)现配现用。

2.皮层分离与细胞纯化：小鼠经异氟烷麻醉后，心脏灌流冷 PBS 去除血液，解剖分离皮层(去除嗅球、小脑及中脑);皮层剪碎后用胶原酶消化缓冲液室温摇床孵育 1 小时，70μm 滤网过滤 + 注射器活塞研磨，500×g 离心 10 分钟;沉淀用 37% 等渗 Percoll 重悬，1200×g 无刹车离心 30 分钟，吸取底部细胞团即为纯化小胶质细胞。

3.培养与维护：纯化细胞用含 GM-CSF 的培养基重悬，以 5×10⁵ cells / 孔接种 12 孔板，37℃ 5% CO₂培养;前 3 天每天全量换液，之后每周两次;细胞达 80% 汇合时用 0.05% 胰酶消化，1:2 传代，传代后次日换液去除残留胰酶，总培养周期可达 30 天。

4.鉴定与功能检测：培养 24 天时，免疫荧光染色 Iba1(小胶质细胞特异性)、TMEM119(小胶质细胞标志物)及 GFAP/NeuN(排除星形胶质细胞 / 神经元污染);培养 28 天时，流式细胞术检测 CD45/CD11b/P2RY12(纯度鉴定)及 MHC I/II、CD68(激活状态)，对比成年与老年细胞差异。

实验结果

Fig1：成年与老年小胶质细胞培养过程中的形态变化

该图为 8 周成年(A)与 18 月龄老年(B)小鼠小胶质细胞培养 28 天的明场图像(20× 放大)：培养 9 天时，成年细胞已可见明显分支状形态，老年细胞仍有较多未分化细胞;12 天时两者均达到成熟状态，呈典型小胶质细胞形态;17-21 天时，细胞分支增多，维持稳态下的分支状表型;28 天时，两者均转为阿米巴样形态(激活态)，且老年细胞成熟速度显著慢于成年细胞，提示老年小胶质细胞在体外仍保留衰老相关的增殖与分化延迟特征，与体内老年小胶质细胞功能下降的表型一致。

Fig2：成年与老年小胶质细胞的纯度鉴定(免疫荧光)

该图为培养 24 天的免疫荧光结果(40× 放大)：成年(A)与老年(B)小胶质细胞均呈 Iba1(绿色)与 TMEM119(浅蓝色)双阳性，DAPI(深蓝色)标记细胞核，无 GFAP(星形胶质细胞)与 NeuN(神经元)染色信号;merged 图像显示几乎所有细胞核均对应 Iba1/TMEM119 阳性细胞，纯度 > 95%，证实该培养方案可获得高纯度小胶质细胞，且无其他神经细胞污染，为后续功能实验排除杂细胞干扰。

Fig3：成年与老年小胶质细胞的激活状态对比(流式细胞术)

该图通过流式分析新鲜分离(A-C)与体外培养 28 天(D-I)的小胶质细胞激活状态：新鲜分离的老年小胶质细胞(B、C)MHC I/II、CD68 表达已高于成年细胞;体外培养后，两者激活标志物水平均升高，但老年细胞(F、H、I)仍显著高于成年细胞(E、G);同时流式门控显示培养细胞中 CD45⁺CD11b⁺P2RY12⁺小胶质细胞比例 > 90%，进一步证实纯度。结果表明体外培养可保留老年小胶质细胞的高激活特征，与体内 “炎症衰老” 表型一致，适合研究衰老相关小胶质细胞功能。

研究结论

本研究建立的老年小鼠小胶质细胞培养方案具有三大优势：1. 高效性：每只小鼠可获～1×10⁶ viable 细胞，纯度 > 95%;2. 稳定性：添加 GM-CSF 可维持细胞存活 30 天，支持长期实验;3. 生理相关性：体外培养的老年小胶质细胞保留 “炎症衰老” 特征，激活标志物水平显著高于成年细胞。该方案填补了老年小胶质细胞模型的空白，为研究衰老相关神经退行性疾病的小胶质细胞机制提供可靠工具，也可用于药物筛选(如调控小胶质细胞激活的化合物)。