M1 巨噬细胞对弓形虫速殖子的早期免疫反应特征

eporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Early responses of primary human and bovine monocytes, monocytic THP-1 cells and THP-1 cell-derived macrophages to vital Toxoplasma gondii tachyzoites

中文标题：人 / 牛单核细胞及 THP-1 来源巨噬细胞对弓形虫速殖子的早期免疫反应特征

发表期刊：《Frontiers in Immunology》

影响因子：5.9

作者单位：

1.Institute of Veterinary Physiology and Biochemistry, Justus Liebig University Giessen, Giessen, Germany

2.Institute of Parasitology, Biomedical Research Center Seltersberg, Justus Liebig University Giessen, Giessen, Germany

3.Unit for Biomathematics and Data Processing, Justus Liebig University Giessen, Giessen, Germany

4.Institute of Molecular Immunology, Biomedical Research Center Seltersberg, Justus Liebig University Giessen, Giessen, Germany

5.Laboratory of Experimental Surgery, Department of General and Thoracic Surgery, German Center for Lung Research (DZL), Cardiopulmonary Institute (CPI), Justus Liebig University Giessen, Giessen, Germany

6.Department of Natural Sciences, Bonn-Rhein-Sieg University of Applied Sciences, Rheinbach, Germany

作者信息：

Dominik Hanke¹,²*, Zahady D. Velásquez², Kathrin Büttner³, Andreas Krueger⁴, Ralf Ross⁴, Andreas Hecker⁵, Sybille Mazurek¹, Veronika Grau⁵, Anja Taubert², Carlos Hermosilla², Katrin Richter⁵,⁶†, Iván Conejeros²†

研究背景

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种人畜共患顶复门寄生虫，全球约三分之一人口血清阳性，先天性感染及免疫缺陷人群感染后果严重。单核吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞)是先天免疫的核心 “第一应答者”，可通过吞噬、细胞因子分泌、释放单核细胞 / 巨噬细胞胞外诱捕网(METs)等机制对抗病原体。此前研究多聚焦于细胞与弓形虫的长时间相互作用，而早期(<4 小时)免疫反应特征尚不明确。本研究系统探究人 / 牛原代单核细胞、THP-1 单核细胞及分化的 M0/M1/M2 型巨噬细胞与弓形虫速殖子共孵育 4 小时后的早期反应，包括 METs 形成、促炎细胞因子分泌及 TLR2/4 表达变化，为弓形虫感染的先天免疫机制提供新见解。

研究方法

本研究采用人 / 牛原代单核细胞(分别通过免疫磁珠分选、密度梯度离心分离)、THP-1 单核细胞及 PMA 诱导分化的 M0/M1/M2 型巨噬细胞为研究对象;弓形虫 RH 株速殖子在 MARC-145 细胞中培养扩增，与免疫细胞以 1:4 的感染复数(MOI)共孵育 4 小时;通过扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、免疫荧光 / 共聚焦显微镜观察细胞形态及 METs(extDNA、组蛋白、MPO 共定位);采用 Sytox Green 荧光法检测胞外 DNA 含量;ELISA 测定 IL-1β、IL-6 分泌水平;流式细胞术分析 TLR2、TLR4、CD11b 及 F-actin 表达;通过 LDH 检测排除细胞毒性干扰;所有统计采用 GraphPad Prism 及 SAS 软件，p≤0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：弓形虫诱导单核吞噬细胞的形态变化

该图展示细胞早期形态激活特征：图 1A 显示人 / 牛原代单核细胞与弓形虫共孵育后，从球形变为胞质铺展、表面皱褶增多，形成丝状伪足和细胞丝，部分可见 METs 样结构及寄生虫捕获;图 1B 显示 THP-1 单核细胞及 M0/M1/M2 巨噬细胞均出现膜突起(以丝状伪足为主)，M0/M1/M2 巨噬细胞的贴壁能力及形态改变更显著，证实所有细胞类型在 4 小时内均被弓形虫激活。

图 2：M1 型巨噬细胞的 ET 样结构释放及弓形虫内化

该图聚焦 M1 巨噬细胞的核心反应：图 2A 为未处理的 M1 巨噬细胞，呈变形虫样，胞质含大量颗粒和囊泡;图 2B-C 显示与弓形虫共孵育后，M1 巨噬细胞释放 ET 样结构(黑色箭头标注)，可捕获速殖子;图 2D 证实部分弓形虫被内化，包裹于吞噬溶酶体样膜结构或纳虫空泡中，提示 M1 巨噬细胞可通过吞噬作用清除寄生虫。

图 3：METs 形成的免疫荧光验证

该图证实 METs 为罕见事件：图 3A-B 显示人 / 牛原代单核细胞、THP-1 系列细胞与弓形虫共孵育后，免疫荧光染色可见 extDNA 与组蛋白共定位的 METs 结构(白色箭头)，但定量分析显示 METs 阳性细胞比例极低，无统计学差异;阳性对照(A23187、尼日利亚菌素)也未显著诱导 METs 形成，提示早期反应中 METs 并非主要防御机制。

图 4：胞外 DNA 含量检测

该图进一步验证 METs 形成情况：人 / 牛原代单核细胞(图 4A-B)、THP-1 系列细胞(图 4C-F)与弓形虫共孵育后，胞外 DNA 含量与对照组无显著差异;而阳性对照 A23187、尼日利亚菌素可显著升高 THP-1 细胞的胞外 DNA 水平(p≤0.05)，再次证实弓形虫早期诱导 METs 形成的效率极低。

图 5：IL-1β 和 IL-6 的分泌特征

该图揭示细胞因子的核心作用：人原代单核细胞与弓形虫共孵育后，IL-1β(图 5A)和 IL-6(图 5B)分泌显著升高(p≤0.05)，LPS 共刺激可进一步增强该效应;THP-1 单核细胞无显著细胞因子分泌(图 5C-D)，M0/M1/M2 巨噬细胞中仅 M1 型可显著分泌 IL-1β(图 5G)，LPS 共刺激可增强所有巨噬细胞的 IL-1β 释放及 THP-1 单核细胞的 IL-6 分泌(图 5D-J);所有组 LDH 水平 < 10%，排除细胞毒性导致的细胞因子释放。

研究结论

本研究首次系统阐明单核吞噬细胞对弓形虫速殖子的早期(4 小时)免疫反应特征：1)所有细胞类型均出现形态激活(胞质铺展、膜突起形成)，M1 巨噬细胞可内化弓形虫;2)METs 形成是罕见事件，并非早期核心防御机制;3)促炎细胞因子(IL-1β、IL-6)分泌是主要早期反应，人原代单核细胞及 M1 型巨噬细胞为主要分泌细胞，LPS 可协同增强效应;4)TLR2/4、CD11b 及 F-actin 表达无显著变化，早期反应不依赖这些受体的表达上调。研究证实弓形虫感染的早期先天免疫以细胞因子分泌为主，METs 作用有限，为理解弓形虫感染的免疫启动机制提供关键数据。