Bdellovibrio 分子工具箱实现基因表达与蛋白分泌精准调控

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：A molecular toolbox to modulate gene expression and protein secretion in the bacterial predator Bdellovibrio bacteriovorus

中文标题：用于调控捕食性细菌 Bdellovibrio bacteriovorus 基因表达与蛋白分泌的分子工具箱

发表期刊：《PLOS Genetics》

影响因子：3.7

作者单位：

1.Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, Zurich, Switzerland

2.Flow Cytometry Facility, University of Zurich, Zurich, Switzerland

3.Department of Ecophysiology, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Marburg, Germany

作者信息：

Ljiljana Mihajlovic¹, Lara M. Hofacker¹, Florian Lindner¹, Priyanikha Jayakumar², Andreas Diepold³¤, Simona G. Huwiler¹*

研究背景

捕食性细菌 Bdellovibrio bacteriovorus 能捕杀并消耗其他细菌，在医学、农业和生物技术领域具有巨大应用潜力(如对抗多重耐药菌、防止食物浪费、分泌水解酶用于生物技术)。但目前其遗传工具有限，缺乏精细调控基因表达和蛋白分泌的方法，制约了基础研究与合成生物学改造。本研究开发了一套分子工具箱，通过系统优化启动子、核糖体结合位点(RBS)和分泌信号肽，实现对 B. bacteriovorus 基因表达的精细调控和蛋白分泌的定量检测，为其广泛应用奠定基础。

研究方法

本研究以 B. bacteriovorus HD100T 为研究对象，E. coli S17-1 等为猎物菌;基于 pCAT.000 载体构建重组质粒，整合不同来源的启动子(B. bacteriovorus 天然启动子、Anderson 库合成启动子)、RBS(天然 RBS、B. bacteriovorus 优化 RBS、E. coli 优化合成 RBS)和 Sec 依赖型信号肽;以密码子优化的 mScarletI3 为荧光报告蛋白，通过流式细胞术和酶标仪定量基因表达水平;建立基于 NanoLuc 荧光素酶的分泌检测体系，量化不同信号肽和启动子对蛋白分泌的影响;采用 LIVE/DEAD 染色结合流式细胞术评估细菌活力，所有实验设生物学重复，统计分析采用相关软件，p<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：筛选 B. bacteriovorus 最优荧光报告蛋白

该图确定核心报告工具：比较 mCherry、mNeonGreen 和 mScarletI3 三种荧光蛋白在 B. bacteriovorus 攻击期(AP)的表达，mScarletI3 荧光强度最高(是 mNeonGreen 的 3 倍、mCherry 的 100 倍)，空白载体对照荧光可忽略，表明 mScarletI3 是该菌基因表达研究的最优报告蛋白(图 1A-B)。

图 2：天然与合成启动子的表达水平差异

该图验证启动子调控效果：天然启动子中，含 FliA 结合基序的启动子(如 Pₘₑᵣᵣₙₐ、Pᵦₙ₀₁₄₉)表达活性更强，Pₘₑᵣᵣₙₐ 是最强天然启动子;非 FliA 依赖型启动子(Pᵦₙ₃₁₈₀、Pᵦₙ₂₂₀₉)表达较弱(图 2A);Anderson 库合成启动子(P_J23119、P_J23104、P_J23102、P_J23100)在 B. bacteriovorus 中均有功能，表达强度呈梯度分布，P_J23119 活性最高，P_J23100 最低(图 2B)。

图 3：启动子在捕食周期中的时间动态表达

该图揭示表达时序特征：合成启动子(P_J23119、P_J23104 等)在捕食早期(0-10 小时)荧光快速升高，启动表达更早;天然启动子(Pᵦₙ₀₀₆₄、Pᵦₙ₀₁₄₉ 等)在捕食 4 小时后才开始显著表达，与 B. bacteriovorus 攻击期天然调控模式一致(图 3A);不同启动子对应的 B. bacteriovorus 裂解猎物的速率(OD₆₀₀ 下降趋势)无显著差异，表明启动子改造不影响其捕食能力(图 3B)。

图 4：RBS 优化增强基因表达效率

该图明确 RBS 的调控作用：去除 RBS 会显著降低天然和合成启动子的 mScarletI3 表达(图 S6-S7);将天然启动子的内源 RBS 替换为 B. bacteriovorus 优化 RBS 后，3/4 天然启动子(Pᵦₙ₀₁₄₉、Pᵦₙ₀₀₆₄、Pᵦₙ₁₉₈₁)的表达水平显著提升，仅 Pᵦₙ₃₁₈₀ 内源 RBS 表现更优(图 4A);E. coli 优化 RBS(BBa-B0034)与合成启动子 P_J23119 搭配效果略优，但与天然启动子 Pᵦₙ₀₁₄₉ 搭配时，表达效率低于 B. bacteriovorus 优化 RBS，凸显物种特异性 RBS 优化的重要性(图 4B)。

图 5：建立 NanoLuc 基于的蛋白分泌检测体系

该图实现分泌定量调控：构建含 Sec 依赖型信号肽的 NanoLuc 分泌载体，分泌的 NanoLuc 可通过荧光反应定量，无信号肽对照组荧光极低(背景水平)(图 5A);启动子强度与分泌效率正相关，Pₘₑᵣᵣₙₐ 驱动的分泌量最高(5.1×10³ a.U.)，P_J23119 和 Pᵦₙ₀₀₆₄ 分泌量约低 13 倍(图 5B);四种信号肽中，ss_Bd2269 和 ss_Bd0468 分泌效率最高(~1.1×10⁴ a.U.)，ss_Bd0120 居中，ss_Bd2692 较弱，但均显著高于背景，表明信号肽选择是分泌效率的关键(图 5C)。

研究结论

本研究成功开发了一套用于 B. bacteriovorus 的分子工具箱，核心包括：1. 最优荧光报告蛋白 mScarletI3 和 NanoLuc 分泌报告系统，实现基因表达与蛋白分泌的精准定量;2. 多强度梯度的天然(含 FliA 依赖型强启动子)和合成启动子(Anderson 库)，满足不同表达需求;3. 物种特异性优化 RBS，可显著增强天然启动子表达;4. 高效 Sec 依赖型信号肽，实现蛋白分泌的精细调控。该工具箱解决了 B. bacteriovorus 遗传改造中基因表达难调控、蛋白分泌难量化的关键问题，为其基础捕食机制研究(如捕食周期调控)和生物技术应用(如定向分泌抗菌酶、生物防治)提供了强大工具，推动该捕食性细菌向实用化改造迈进。