rhBMP9 逆转博来霉素诱导的肺纤维化与肺动脉高压

测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：Dysregulation of BMP9/BMPR2/SMAD Signaling Pathway Contributes to the Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis and Pulmonary Hypertension in a Rat Model

中文标题：BMP9/BMPR2/SMAD 信号通路失调参与博来霉素诱导大鼠肺纤维化及肺动脉高压的发病机制

发表期刊：《British Journal of Pharmacology》

影响因子：7.7

作者单位：

1.State Key Laboratory of Respiratory Disease, National Clinical Research Center for Respiratory Disease, Guangdong Key Laboratory of Vascular Disease, Guangzhou Institute of Respiratory Health, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, China;

2.Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, The People’s Hospital of Inner Mongolia, Huhhot, Inner Mongolia, China;

3.Section of Physiology, Division of Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, University of California, San Diego, La Jolla, California, USA.

作者信息：

Qian Jiang, Chunli Liu, Shiyun Liu, Wenju Lu, Yi Li, Xiaoyun Luo, Ran Ma, Chenting Zhang, Haixia Chen, Yuqin Chen, Zizhou Zhang, Cheng Hong, Wenliang Guo, Tao Wang, Kai Yang, Jian Wang

研究背景

与肺纤维化(PF)相关的肺动脉高压(PH)属于 WHO III 组 PH，是临床常见亚型且缺乏有效治疗手段。BMP9/BMPR2/SMAD 信号通路在多种 PH 亚型中被证实参与疾病进展，但在 PF 相关 PH 中的作用尚未明确。本研究旨在探讨该通路在博来霉素(BLM)诱导的 PF 及 PH 大鼠模型中的表达变化、作用机制，以及重组人 BMP9(rhBMP9)的治疗潜力，为该亚型 PH 的治疗提供新策略。

研究方法

本研究以雄性 SD 大鼠为动物模型，通过气管内注射 5mg/kg 博来霉素建立 PF 及 PH 模型，设对照组及 BLM 处理 7、14、21、28、35 天组，另设 rhBMP9 治疗组(600ng/day 腹腔注射，持续 3 周);分离大鼠原代肺微血管内皮细胞(PMVECs)作为细胞模型，分为对照组、BLM 处理组(2.5μg/ml)及 rhBMP9 干预组(1ng/ml)。采用血流动力学检测(BIOPAC 系统)测定右心室收缩压(RVSP)，计算 Fulton 指数(RV/(LV+S))评估右心室肥厚(RVH);肺功能检测(DSI Buxco PFT 系统)测定肺顺应性(Cchord)、用力肺活量(FVC)等指标;组织学染色(H&E、Masson 三色染色)观察肺组织纤维化及肺动脉重塑，免疫组化、免疫荧光检测 BMP9、α-SMA(平滑肌标志物)、vWF(内皮标志物)表达;Western blot 检测 BMP9、BMPR2、磷酸化 Smad1/5/9(p-Smad1/5/9)及凋亡相关蛋白(cleaved caspase 3)水平;流式细胞术检测 PMVECs 凋亡率;所有统计分析采用 SPSS13.0 软件，p<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：博来霉素诱导大鼠肺功能进行性损伤及胶原沉积

该图证实 BLM 诱导 PF 的成功建立：BLM 处理后，大鼠肺顺应性(Cchord)、用力肺活量(FVC)、功能残气量(FRC)进行性下降，吸气阻力(RI)晚期(28-35 天)显著升高(图 1A-D)，提示肺功能受损;Masson 三色染色显示，BLM 处理后肺组织及血管周围胶原沉积(蓝色染色)逐渐增加，呈时间依赖性(图 1E)，符合 PF 病理特征。

图 2：博来霉素诱导大鼠肺动脉高压相关指标进行性升高

该图明确 BLM 诱导 PH 的病理表现：BLM 处理后，RVSP 呈时间依赖性升高，14 天起显著高于对照组(图 2A-B);Fulton 指数同步升高，提示 RVH(图 2C);H&E 染色及定量分析显示，肺动脉壁厚度(WT%)和壁面积(WA%)自 7 天起开始增加，随时间持续加重，提示肺动脉重塑(图 2D-F)。

图 3：博来霉素诱导大鼠肺动脉内皮进行性损伤

该图揭示血管内皮损伤特征：免疫荧光双染色(α-SMA 红色、vWF 绿色)显示，BLM 处理 7 天即可观察到肺动脉平滑肌层增厚，同时 vWF 荧光强度显著降低，且内皮损伤随时间持续加重(图 3A-C)，表明 BLM 早期即导致肺动脉内皮丢失，与肺动脉重塑同步发生。

图 4：博来霉素诱导大鼠肺组织 BMP9/BMPR2/SMAD 通路持续下调

该图明确通路表达变化：免疫组化显示，BMP9 主要表达于肺动脉内皮、气道及肺间质，BLM 处理后其表达自 7 天起显著降低，持续至 35 天(图 4A-B);Western blot 证实，肺组织中 BMP9、BMPR2 蛋白水平及 p-Smad1/5/9 均呈时间依赖性下调，通路持续受抑(图 4C-F)。

图 5：博来霉素下调原代 PMVECs 中 BMP9/BMPR2/SMAD 通路并诱导凋亡

该图验证细胞水平通路变化：BLM 处理 PMVECs 48-72 小时后，BMP9、BMPR2 蛋白及 p-Smad1/5/9 水平显著降低(图 5A-D);rhBMP9 可时间依赖性诱导对照组 PMVECs 的 Smad1/5/9 磷酸化，但 BLM 处理后该激活效应被显著抑制(图 5E-F);流式细胞术显示，BLM 处理 48 小时后 PMVECs 凋亡率显著升高(图 5G-H)。

图 6：rhBMP9 治疗改善博来霉素诱导的肺动脉高压及肺纤维化

该图展示 rhBMP9 的治疗效果：rhBMP9 处理显著降低 BLM 诱导的 RVSP 升高(图 6A-B)，抑制 Fulton 指数增加(图 6C);H&E 染色及定量分析显示，rhBMP9 减少肺动脉壁厚度和壁面积，改善血管重塑(图 6D-F);Masson 三色染色显示，rhBMP9 抑制血管周围胶原沉积，减轻肺纤维化(图 6G)。

图7：rhBMP9 保护博来霉素诱导的肺动脉内皮损伤

该图明确rhBMP9 对内皮的保护作用：免疫荧光染色显示，BLM 组 vWF 荧光强度显著降低，α-SMA 荧光强度升高;而 rhBMP9 治疗后，vWF 表达恢复，α-SMA 表达降低，提示内皮损伤改善，平滑肌增生受抑(图 7A-C)。

图 8：rhBMP9 恢复博来霉素下调的 BMP9/BMPR2/SMAD 通路

该图证实治疗的分子机制：Western blot 显示，BLM 组肺组织中 BMPR2、p-Smad1/5/9 水平显著降低，cleaved caspase 3 水平升高;rhBMP9 治疗后，BMPR2 表达及 Smad1/5/9 磷酸化恢复，cleaved caspase 3 水平降低，提示通路激活且细胞凋亡受抑(图 8A-D)。

研究结论

本研究证实，博来霉素气管内注射可成功诱导大鼠同时发生肺纤维化和肺动脉高压，且 PH 相关病理改变(肺动脉重塑、内皮损伤)于 7 天早期即出现，早于右心室肥厚(14 天)，提示 PH 与 PF 平行发生而非继发于 PF。核心机制为 BMP9/BMPR2/SMAD 信号通路早期(7 天)即开始持续下调，导致肺动脉内皮细胞凋亡增加、内皮丢失，进而引发肺动脉重塑和 PH。重组人 BMP9 治疗可有效恢复该通路活性，抑制内皮损伤、血管重塑及胶原沉积，显著改善 PH 相关血流动力学指标和肺功能。该研究揭示了 BMP9/BMPR2/SMAD 通路在 PF 相关 PH 中的关键作用，为 WHO III 组 PH 提供了以该通路为靶点的潜在治疗策略。