血管网络启发的可扩散支架用于构建功能性中脑类器官

类器官是由干细胞衍生的三维组织培养物，在发育生物学、药物发现和再生医学领域展现出显著潜力。这些体外培养的微型器官能够重现人类器官的关键分子、细胞、结构和功能特征。特别是人脑类器官可以模拟发育中人脑的特性，为研究神经发育、神经退行性疾病和精神疾病提供了宝贵工具。然而，当前类器官研究面临着一个显著的局限性：由于缺乏血管化和循环系统，无法为类器官内部细胞提供充足的氧气、营养物质和生长因子，同时难以排除代谢废物。这导致类器官内部形成应激、缺氧和坏死区域，进而影响类器官的发育和成熟，可能导致异质性、可重复性和通量问题。

2025年3月8日，发表在Cell Stem Cell上题为Vascular network-inspired diffusible scaffolds for engineering functional midbrain organoids的研究为解决这一问题，研究人员尝试了多种方法，如将人脑类器官移植到啮齿动物宿主体内以利用宿主血管化，或利用气-液界面培养来增强氧气、营养物质和生长因子的扩散。此外，一些先进的工程方法如器官芯片和血管芯片也被开发用于改善类器官的扩散环境。然而，这些方法通常复杂且难以在普通实验室环境中实施。因此，开发简单而稳健的方法来支持神经类器官发育的需求迫切。

图示描述

1) VID支架设计与工程化神经类器官的生成。研究团队设计了血管网络启发的可扩散(VID)支架，该支架模拟了生理血管网络的扩散特性。支架由6根平行排列的空心网格管构成，直径为200微米，管壁厚度为50微米，开口大小为20微米，管间距为200微米，形成2.5毫米×2.5毫米的扁平矩阵结构。这些特征旨在确保类器官细胞的最大扩散距离不超过150微米，从而避免缺氧和坏死。研究人员使用这些支架成功制备了扁平化的工程化神经类器官(ENOs)，与传统球形类器官(CNOs)相比，ENOs具有显著减少的缺氧和坏死区域，并在长期培养中保持健康生长。

2) 增强的培养基、氧气和信号分子扩散。VID支架能够通过其扩散管网络将携带营养物质的培养基、氧气和信号分子直接供应给类器官细胞。实验证明，支架内的灌注流能够将新鲜培养基通过可灌注管网络转移到周围类器官组织。缺氧染色显示，在培养15、30、60和180天的ENOs中几乎没有缺氧现象，而CNOs则发展出明显的缺氧核心和坏死区域。此外，使用不同分子量的染料(Hoechst、CF 488A WGA和CF@594 Con A)进行的灌注实验表明，ENOs中所有三种分子的荧光分布得到增强和均匀，而在CNOs中，只有一层浅层荧光分布在表面，表明支架显著增强了灌注和组织渗透。

3) 减轻细胞应激和持续的神经发生。研究发现，与CNOs相比，ENOs具有减少的细胞死亡、缓解的细胞应激和持续的神经发生。免疫组织化学分析表明，CNOs在培养15天时开始出现明显的坏死核心，并持续扩大，而ENOs则缺乏坏死核心，并在非坏死增殖区域显示较少的细胞死亡。此外，ENOs随时间保持了神经前体细胞(NPC)的比例，而CNOs则随时间降低了NPC比例。单细胞RNA测序分析进一步证实，CNOs中的NPCs上调了与内质网应激、缺氧、营养不良导致的受损代谢和细胞凋亡相关的基因，而ENOs中的NPCs则更多表达与细胞周期、DNA复制和神经发育路径相关的基因。

4) 促进中脑区域特异性分化。研究显示，减少的细胞死亡、缓解的细胞应激和持续的神经发生使ENOs具有更好的中脑分化，更接近真实的胚胎中脑。分析显示，ENOs和CNOs都发展出三个细胞层，包括位于室壁带的Ki67+增殖细胞、位于中间带的FOXA2+多巴胺能前体细胞和位于外套带的MAP2+神经元。然而，ENOs的神经上皮中Ki67+/FOXA2+增殖性多巴胺能前体细胞比例更高(31%对15%)。进一步分析表明，ENOs的室壁带中LMX1A+多巴胺能前体细胞(46%对23%)和Ki67+/LMX1A+增殖性多巴胺能前体细胞(28%对12%)比例也更高。此外，ENOs中多巴胺能神经元在成熟神经元中的比例也更高(37%对25%)，基因表达分析和多巴胺检测进一步证实了ENOs的增强中脑特异性分化。

5) 改善神经活动和网络功能。利用多电极阵列(MEA)系统测量和记录神经类器官的神经活动，研究团队发现ENOs展现出比CNOs更好的神经活动和网络功能。由于ENOs的扁平形状，它们能更好地贴附在MEA芯片上，而支架特有的生理扩散功能继续为类器官提供营养物质和氧气，支持能量消耗大的神经网络功能。通过自发活动的定量分析，发现ENOs显示出显著更好的神经活动，包括更多的活性电极(42.5对24.3)更高的爆发频率(0.52Hz对0.21Hz)和平均发放率(3.12Hz对1.05Hz)。此外，ENOs具有显著增强的功能连通性，如经典网络指数(平均聚类、局部效率、全局效率和网络密度)所量化。ENOs也表现出明显更高振幅的尖峰，表明神经元的成熟程度更高。

6) 增强的药理学反应。研究者验证了ENOs对芬太尼(一种广泛用于缓解疼痛的有效麻醉药)的神经活动反应。同一ENOs在用临床相关浓度(50 nM)芬太尼处理前后记录自发活动，结果显示明显的药理学效应，包括尖峰事件和爆发的减少，以及同步网络活动的随后丧失。相比之下，CNOs的电活动对芬太尼几乎没有显著反应。单细胞RNA测序分析进一步揭示，芬太尼处理的ENOs中的神经元和星形胶质细胞中上调的基因富集在与应激、凋亡和衰老相关的术语中，而对照组中则更多表达与多巴胺处理、神经元发育以及轴突和突触形成相关的基因。与CNOs相比，ENOs对芬太尼表现出更加生理相关的反应，为神经功能为基础的化合物和物质筛选提供了一个有前景的平台。

全文总结

这项研究开发的血管网络启发的可扩散(VID)支架为类器官研究提供了一种创新解决方案。通过模拟生理血管网络的扩散特性，VID支架显著改善了类器官的发育、成熟和功能。在中脑类器官中，该技术显著减少了缺氧和坏死区域，促进了区域特异性分化，并增强了神经活动和提高了药物反应。减少的细胞应激和持续的神经发生意味着这些工程化类器官具有更高的可重复性和更少的异质性。此外，增强的药理学反应表明，这些类器官能够更准确地预测药物在人体中的效果，尤其在神经系统疾病方面。该技术简单且与标准实验室设备兼容，易于在普通实验室环境中应用。总体而言，这项研究不仅改进了类器官培养方法，还为类器官技术在神经科学和药物开发中的广泛应用奠定了基础。