肿瘤/炎症成像新工具：H₂S 特异性近红外探针 HCy-SSPy 的核心优势

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Fast-Response Mitochondria-Targeted Fluorescent Probe for (H₂S) Imaging in Tumors and Inflammation发表期刊Chemical & Biomedical Imaging

中文标题：线粒体靶向快速响应近红外荧光探针 HCy-SSPy 用于肿瘤及炎症中 H₂S 成像

发表期刊：《Chemical & Biomedical Imaging》

影响因子：5.7

作者单位：

1.Key Laboratory of Emergency and Trauma, Ministry of Education, Key Laboratory of Haikou Trauma, Key Laboratory of Hainan Trauma and Disaster Rescue, The First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Hainan Medical University, Haikou 571199, China

2.Engineering Research Center for Hainan Bio-Smart Materials and Bio-Medical Devices, Key Laboratory of Hainan Functional Materials and Molecular Imaging, College of Emergency and Trauma, Hainan Medical University, Haikou 571199, China

3.College of Chemistry and Chemical Engineering, School of Medicine, Linyi University, Shandong 276005, China

4.First School of Clinical Medicine, Anhui Medical University, Hefei 230032, China

作者信息：

Huixiang Wang¹,²,³, Erting Feng¹,², Huizhen Ma¹,², Fangfang Du¹,², Muyang Chen⁴, Zongjin Qu³, Fabiao Yu¹,²,⁎

研究背景

硫化氢((H₂S))作为第三类内源性气体信号分子，参与心血管调节、神经传导、抗炎抗氧化等生理过程，其水平异常与肿瘤、神经退行性疾病、炎症等密切相关。现有(H₂S)检测方法(电化学、色谱法等)存在易干扰、操作繁琐、无法实时成像等局限，已报道的荧光探针多响应时间长(分钟至小时级)，难以捕捉(H₂S)动态变化。本研究基于二硫键断裂机制，设计合成近红外(NIR)荧光探针 HCy-SSPy，以半花菁(HCy-NH₂)为荧光团，不对称吡啶二硫醚(SSPy)为(H₂S)特异性识别基团，实现快速、高选择性、线粒体靶向的(H₂S)成像，为(H₂S)相关疾病研究提供工具。

研究方法

本研究通过有机合成法制备探针 HCy-SSPy，经柱层析纯化并通过 ¹H NMR 和 HRMS 验证结构;在 PBS-DMSO 缓冲液(4:1)中测试探针光学性能，包括吸收 / 荧光光谱、选择性(针对金属离子、阴离子、生物硫醇等)、响应时间、pH 稳定性及检测限(LOD);以 4T1 细胞为模型，通过 MTT 法检测细胞毒性，共定位实验(与 Rhodamine 123)验证线粒体靶向性;分别用 NaHS(外源性)、Cys(内源性前体)、LPS(炎症诱导剂)处理细胞，结合探针进行荧光成像;构建 4T1 肿瘤裸鼠模型和 LPS 诱导的炎症小鼠模型，通过活体成像观察探针在体内的(H₂S)检测效果;所有统计分析采用相关软件，p<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：HCy-SSPy 的光学性能表征

该图验证探针核心检测性能：探针自身荧光微弱，加入(H₂S)后，吸收峰从 615 nm 红移至 660 nm，溶液颜色从蓝色变为绿色，765 nm 处近红外荧光显著增强(图 1A-B);荧光强度与(H₂S)浓度呈良好线性关系，检测限低至 0.36 μM(图 1C);对(H₂S)具有高选择性，不受生物硫醇(GSH、Cys、Hcy)及其他离子干扰(图 1D);响应速度极快，约 5 秒即可达到荧光稳定平台(图 1E);在 pH 6.0-10.0 范围内均能有效响应，适配生理环境(图 1F)。

图 2：外源性(H₂S)的细胞荧光成像

该图展示细胞水平外源性检测能力：4T1 细胞经不同浓度 NaHS(0-100 μM)预处理后，与探针孵育，荧光信号随 NaHS 浓度增加而逐渐增强(图 2A-B)，表明探针可定量检测细胞内外部来源的(H₂S)，且成像效果清晰，背景干扰低(比例尺 20 μm)。

图 3：内源性(H₂S)的细胞荧光成像

该图验证内源性检测特异性：用 Cys(0-200 μM)预处理细胞以诱导内源性(H₂S)生成，探针荧光强度呈 Cys 剂量依赖性升高(图 3A-B);加入 CBS 抑制剂 AOAA 后，荧光信号显著减弱，证实荧光增强源于内源性(H₂S)，而非其他代谢产物(图 3A)。

图 4：LPS 诱导炎症细胞中(H₂S)的动态成像

该图体现炎症相关检测价值：4T1 细胞经 LPS(1.0 μg/mL)处理 1-5 小时后，探针荧光信号随处理时间延长逐渐增强(图 4A-B)，表明炎症过程中细胞内(H₂S)水平持续升高，探针可实时监测炎症相关的(H₂S)动态变化。

图 5：肿瘤裸鼠体内(H₂S)成像

该图证实体内肿瘤检测效果：4T1 肿瘤裸鼠经 Cys 预处理诱导内源性(H₂S)后，瘤内注射探针，肿瘤部位荧光强度随时间(0-50 分钟)逐渐升高(图 5A-B);解剖后成像显示，肿瘤组织荧光强度显著高于心、肝、脾、肺、肾等主要器官，探针在肿瘤部位特异性富集(图 5C)。

图 6：炎症小鼠体内(H₂S)成像

该图验证体内炎症检测潜力：小鼠腹腔注射 LPS(1.0 mg/mL)8 小时诱导局部炎症后，注射探针，炎症部位随时间呈现明显荧光增强(图 6A-B);仅注射探针的对照组无显著荧光，表明探针可特异性识别炎症微环境中的(H₂S)。

研究结论

本研究成功开发近红外荧光探针 HCy-SSPy，基于二硫键断裂机制实现(H₂S)的 “开启型” 成像，核心优势包括：1)快速响应(~5 秒)，可捕捉(H₂S)动态变化;2)高选择性和灵敏度(LOD=0.36 μM)，不受生物硫醇及其他生物分子干扰;3)线粒体靶向性(Pearson 系数 = 0.90)，精准定位亚细胞结构;4)低细胞毒性，生物相容性良好;5)近红外发射(765 nm)，适配体内成像。该探针可有效检测细胞内外源性 / 内源性(H₂S)，成功实现肿瘤和炎症模型小鼠的(H₂S)活体成像，为(H₂S)相关生理病理机制研究及疾病早期诊断提供了高效工具。