新生小鼠脑少突胶质前体细胞（OPCs）高效原代培养方案：无需特异性抗体与特殊设备

少突胶质前体细胞(OPCs)是中枢神经系统髓鞘形成的核心前体细胞，对脱髓鞘疾病(如多发性硬化)研究及髓鞘修复至关重要。现有 OPCs 培养方法多依赖大鼠组织，小鼠 OPCs 因标志物差异(不表达大鼠 OPCs 的 A2B5/GD3)、易分化、分离难度大，长期缺乏可靠方案;且传统方法需免疫磁珠或流式分选(成本高、设备依赖强)。海军军医大学尚耀琴、苏志达团队在《Brain Research》(2025, 1853:149519)发表优化方案：以 3 日龄(P3)新生小鼠皮层为材料，通过优化摇瓶参数(250rpm×6h)，无需特异性抗体，即可高效分离纯度 > 90% 的 OPCs，且细胞可体外扩增 4 代、分化为成熟少突胶质细胞，为小鼠 OPCs 相关研究及脱髓鞘疾病建模提供关键工具。

本研究旨在建立简单、经济、高效的新生小鼠 OPCs 原代培养方法，解决传统方法的技术瓶颈。方法：1. 筛选最佳小鼠日龄(P0/P3/P7)，确定 P3 为最优材料来源;2. 混合胶质细胞培养 10 天后，优化摇瓶参数(转速 210-270rpm、时间 4-10h)，去除小胶质细胞后分离 OPCs;3. 通过免疫荧光(PDGFRα/OLIG2/SOX10)、Western blot、RNA-seq 鉴定 OPCs 身份，FACS 验证纯度;4. 检测 OPCs 增殖能力(Ki67 染色)及分化潜力(诱导为星形胶质细胞 / 成熟少突胶质细胞)。结果：P3 小鼠皮层经 250rpm 摇 6h 分离的 OPCs 纯度 > 90%，可体外扩增 4 代，且能分化为表达 MBP 的成熟少突胶质细胞。结论：该方案无需特殊设备与抗体，实现小鼠 OPCs 高效分离，推动髓鞘相关研究。

研究背景

OPCs 通过分化为少突胶质细胞形成髓鞘，维持神经信号传导，其功能异常与多发性硬化、脑白质损伤等密切相关。小鼠因转基因模型丰富，是 OPCs 病理机制研究的理想动物，但小鼠 OPCs 培养长期面临困境：1. 物种差异：小鼠 OPCs 不表达大鼠 OPCs 的经典标志物，传统免疫分选方法失效;2. 分离难度大：小鼠 OPCs 在混合培养中易提前分化，且与星形胶质细胞黏附紧密，摇瓶分离易导致细胞损伤;3. 成本高：免疫磁珠或流式分选需昂贵抗体与设备，难以普及。本研究通过优化材料来源与摇瓶参数，首次建立无需特异性抗体的小鼠 OPCs 高效分离方案，填补领域空白。

实验方法

动物与试剂：P3 新生 C57BL/6 小鼠及 Pdgfra-eGFP 转基因小鼠(伦理审批：海军军医大学医学伦理委员会);培养基为 DF-12+10% FBS(混合胶质细胞)、DF-12+1% N2+1% B27+10ng/mL PDGF-AA/FGF2(OPCs 生长);消化用 0.25% 胰酶。

混合胶质细胞培养：P3 小鼠皮层解剖去脑膜，剪碎后 0.25% 胰酶 37℃消化 15min，100μm 滤网过滤，1000rpm 离心 5min，以 3-5×10⁵ cells/cm² 接种于 PDL 包被瓶，37℃ 5% CO₂培养 10 天(每 2 天换液)。

OPCs 分离：混合胶质细胞汇合后，180rpm 摇 1h 去除松散小胶质细胞;换新鲜培养基，250rpm 摇 6h，收集细胞悬液，转移至未包被培养皿孵 1h(去除残留小胶质细胞)，1000rpm 离心 4min，重悬于 OPCs 生长培养基。

鉴定与功能检测：免疫荧光染色(PDGFRα/OLIG2/SOX10 鉴定 OPCs;MBP 鉴定成熟少突胶质细胞);Western blot 检测 PDGFRα/OLIG2 蛋白;RNA-seq 分析 OPCs 特异性基因;FACS 验证纯度;Ki67 染色检测增殖。

实验结果

图 1：最佳小鼠日龄筛选(P3 为最优)

该图通过 Pdgfra-eGFP 转基因小鼠追踪 OPCs：P0-P7 小鼠中，P3 小鼠皮层 OPCs 数量显著高于 P0(Fig1A/B/E/F)，且增殖活性(Ki67 阳性率)高于 P7(Fig1C/D/G/H);体外培养 10 天后，P3 来源的 GFP 阳性 OPCs 数量最多(Fig1I/J)。原因是 P3 小鼠皮层处于 OPCs 第三波生成期(占成年 OPCs 的 80%)，兼具高数量与高增殖活性，确定 P3 为最优材料来源。

图 2：混合胶质细胞培养状态

该图显示 P3 小鼠皮层混合胶质细胞培养 10 天的形态：星形胶质细胞形成单层基底，大量 OPCs(呈双极 / 三极形态)附着于星形胶质细胞表面(Fig2A);Pdgfra-eGFP 小鼠来源的混合培养中，表层细胞几乎均为 GFP 阳性(Fig2B)，证实混合培养中 OPCs 富集于表层，为后续摇瓶分离奠定基础。

图 3：摇瓶时间优化(6h 最佳)

该图比较 4-10h 摇瓶时间的影响：随时间延长，收集细胞数量增加(10h 最多)，但 OPCs 纯度(PDGFRα⁺OLIG2⁺)在 6h 后显著下降(8h/10h 纯度降低)(Fig3A-D);且 10h 摇瓶导致 OPCs 凋亡率升高(CASPASE-3 阳性率增加)(Fig3E-F)。4h 与 6h 纯度无差异，但 6h 细胞产量更高，故确定 6h 为最优时间。

图 4：摇瓶转速优化(250rpm 最佳)

该图比较 210-270rpm 转速的影响：270rpm 时收集细胞数量最多，但 OPCs 纯度显著低于 210-250rpm(Fig4A-D);且 270rpm 导致 OPCs 凋亡率升高(Fig4E-F)。210-250rpm 纯度无差异，但 250rpm 细胞产量更高，故确定 250rpm 为最优转速。

图 5：FACS 验证 OPCs 纯度(>90%)

该图通过 Pdgfra-eGFP 小鼠的 FACS 分析：以细胞大小(FSC)、颗粒度(SSC)设门，排除 doublets 后，GFP 阳性 OPCs 比例达 95.6%，证实经 250rpm×6h 分离的 OPCs 纯度 > 90%，且无需特异性抗体染色。

图 6：OPCs 生物学鉴定(身份与增殖)

该图验证 OPCs 特性：分离的细胞呈典型双极 / 三极形态(Fig6A);RNA-seq 显示高表达 OPCs 标志物(Pdgfra/Olig2/Sox10)及少突胶质细胞谱系基因(Mbp/Plp1)(Fig6B);免疫荧光证实 PDGFRα/OLIG2/SOX10/NG2 均阳性(Fig6C);Western blot 检测到 PDGFRα(160-200kD)与 OLIG2(37kD)蛋白(Fig6D);细胞可体外扩增 4 代，P1 代 Ki67 阳性率(~26%)高于 P4 代，但仍保持增殖能力(Fig6E-G)。

图 7：OPCs 分化潜力(双向分化)

该图验证 OPCs 功能：在含 10% FBS 的培养基中，OPCs 可分化为 GFAP 阳性的星形胶质细胞(Fig7A);在含 T3(40ng/mL)的无丝裂原培养基中，5 天内可分化为多突起的成熟少突胶质细胞，且表达髓鞘标志物 MBP(Fig7B-D);Western blot 证实 MBP 蛋白随分化时间增加(Fig7E)，证实 OPCs 具备双向分化能力。

图 8：完整实验流程示意图

该图总结四步流程：1. P3 小鼠皮层解剖去脑膜;2. 胰酶消化制备单细胞悬液;3. 混合胶质细胞培养 10 天;4. 180rpm 摇 1h 去小胶质细胞，250rpm 摇 6h 分离 OPCs，未包被皿孵 1h 进一步纯化。流程简洁，无需特殊设备，可 14 天内获得高纯度 OPCs。

研究结论

本研究通过三方面优化，建立小鼠 OPCs 高效培养方案：1. 材料来源：P3 新生小鼠皮层(第三波 OPCs 富集，高数量高增殖);2. 分离参数：250rpm 摇 6h(平衡产量与纯度，避免细胞凋亡);3. 纯化策略：摇瓶前去除小胶质细胞，分离后未包被皿孵育(进一步去除杂质细胞)。该方案无需特异性抗体与流式 / 磁珠设备，OPCs 纯度 > 90%，可体外扩增 4 代、分化为成熟少突胶质细胞，显著降低实验成本与技术门槛，为小鼠 OPCs 相关病理机制研究及脱髓鞘疾病建模提供可靠工具。