人原代支气管上皮细胞（NHBECs）ALI 培养与组织学分析标准化方案

人原代支气管上皮细胞(NHBECs)气液界面(ALI)培养是气道研究核心工具，但组织学处理(冷冻切片、染色)因膜易损、步骤不标准受限。美国贝勒大学团队在《MethodsX》(2025,15:103492)发表方案：通过胶原包被 Transwell 膜、蔗糖梯度保护、标准化 H&E/PAS 染色，建立 “扩增 - ALI 分化 - 组织学分析” 流程，21-28 天可获假复层上皮，解决膜脱落、染色模糊问题，支撑气道生物学与毒理学研究。

本研究旨在建立标准化 NHBECs ALI 培养及组织学分析流程，解决膜完整性差、染色不稳定问题。方法：早期传代 NHBECs 浸没扩增，接种胶原包被 Transwell 膜;汇合后换 PneumaCult™-ALI 培养基(21-28 天 ALI 分化);4% PFA 固定、蔗糖梯度保护、OCT 包埋切片(5μm)，H&E/PAS 染色。结果：NHBECs 形成假复层上皮，纤毛清晰、无膜脱落。结论：该 protocol 实现标准化，适用于气道上皮功能与毒理学研究。

研究背景

气道上皮是呼吸防御核心，NHBECs ALI 模型因模拟体内结构(黏液纤毛分化、屏障形成)，广泛用于毒理学与疾病建模。但现有方案中，Transwell 膜冷冻切片、染色的技术细节未标准化，膜包埋易损、漂洗 / 切片厚度影响染色质量。本研究提供完整分步流程，优化 OCT 包埋、Coplin jar 漂洗等技术，提升可重复性，适用于上皮重塑、黏蛋白研究及环境暴露响应评估。

实验方法

NHBECs 扩增：取早期传代(1-4 代)NHBECs(ATCC PCS-300-010)，用含支气管上皮细胞生长试剂盒、青链霉素的气道上皮基础培养基，37℃、5% CO₂浸没培养，70-80% 汇合时传代(0.05% 胰酶消化，5% FBS PBS 中和)。

ALI 分化：Transwell 膜(0.4μm 孔，Corning 3470)用 1:10 胶原包被(4℃过夜);NHBECs 以 1×10⁶ cells/mL 接种膜顶端，基底室加培养基，2-4 天汇合后，仅基底室换 PneumaCult™-ALI 培养基，21-28 天维持 ALI(每 2 天换液，每周 PBS 清理顶端黏液)。

组织学处理：分化后 PBS 漂洗，4% PFA 双室固定 30 分钟;10%-20% 蔗糖室温各 30 分钟、30% 蔗糖 4℃过夜保护;手术刀分离膜，OCT 包埋(细胞面朝下)，干冰冷冻;冷冻切片机切 5μm 厚片，贴防脱载玻片。

染色：H&E 染色(过滤苏木精孵 1 分钟→Scott 液蓝化→酸化石蜡红孵 30 秒→梯度乙醇脱水→二甲苯透明→封片);PAS 染色(0.5% 过碘酸孵 2-3 分钟→Schiff 试剂孵 2-3 分钟→苏木精复染→脱水封片)。

实验结果

图 1：NHBECs 在 ALI 分化过程中的形态动态变化

相差显微镜显示：ALI 启动 1 天(Day1)细胞不规则、接触稀疏;Day7 汇合度提升、呈多边形;Day14 连接紧密、上皮层均匀;Day21 形成致密分层假复层上皮(比例尺 100μm)。证实 21 天 ALI 可诱导完整黏液纤毛分化，为组织学分析提供合格模型。

图 2：Transwell 膜的固定、冷冻保护与 OCT 包埋流程

展示核心步骤：ALI 后膜经 PBS 漂洗、4% PFA 固定，10%-20%-30% 蔗糖梯度保护(30% 蔗糖 4℃过夜)，手术刀分离膜并定向 OCT 包埋(红墨水标记方向)、干冰冷冻。解决传统膜脱落、细胞断裂问题。

图 3：OCT 包埋膜的冷冻切片操作

关键操作：OCT 块垂直安装(膜与刀片垂直)，切片厚度设 5μm，细画笔引导切片，用防脱载玻片收集，避免防卷玻璃。提升切片完整性，降低折叠、脱落风险。

图 4：H&E 与 PAS 染色的组织学结果

H&E 染色显示规整假复层上皮(细胞核深蓝、纤毛淡粉);PAS 染色中黏蛋白呈紫红色(细胞核蓝染，20× 放大，比例尺 50μm)。过滤染色试剂、温和漂洗，解决背景污染与染色不均。

研究结论

该方案三大优势：ALI 培养 21-28 天 NHBECs 分化一致(假复层上皮);蔗糖保护 + 定向包埋确保组织完整;标准化染色(H&E/PAS)结果可靠。可广泛用于气道黏液纤毛功能研究、吸入毒理学评估及药物筛选，为呼吸道疾病机制研究提供优质体外模型。