肺动脉高压新靶点！Cavin-1通过竞争性结合 CAV1 抑制 BMP/Smad 信号

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：The Cavin-1/Caveolin-1 interaction attenuates BMP/Smad signaling in pulmonary hypertension by interfering with BMPR2/Caveolin-1 binding

中文标题：Cavin-1/Caveolin-1 相互作用通过干扰 BMPR2/Caveolin-1 结合减弱 BMP/Smad 信号，参与肺动脉高压发病

发表期刊：《Communications Biology》

影响因子：5.1

作者单位：

1.Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Medical Science, Kyoto Prefectural University of Medicine, Kyoto 602-8566, Japan

2.Department of Pathology and Cell Regulation, Graduate School of Medical Science, Kyoto Prefectural University of Medicine, Kyoto 602-8566, Japan

作者信息：

Shinya Tomita¹, Naohiko Nakanishi¹✉, Takehiro Ogata¹,², Yusuke Higuchi¹, Akira Sakamoto¹, Yumika Tsuji¹, Takaomi Suga¹ & Satoaki Matoba¹

研究背景

肺动脉高压(PAH)是一种进展性致命疾病，肺血管重塑导致右心衰竭，目前缺乏根治性治疗。BMPR2(骨形态发生蛋白 2 型受体)突变是 PAH 的主要遗传病因，其定位于小窝结构并与 Caveolin-1(CAV1)相互作用，调控 BMP/Smad 信号。Cavin-1 是小窝的核心组件，与 CAV1 共同维持小窝结构稳定，但二者在 PAH 中与 BMP/Smad 信号的关联机制尚未明确。本研究旨在阐明 Cavin-1/CAV1 系统调控 BMP/Smad 信号的分子机制，为 PAH 寻找新治疗靶点。

实验方法

本研究通过分离小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)、肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)及人肺动脉内皮细胞(hPAECs)，采用 siRNA 沉默、过表达质粒转染调控 CAV1 和 Cavin-1 表达;借助 Western blot、免疫沉淀、GST pulldown、邻近连接分析(PLA)验证蛋白相互作用及信号通路激活;通过蔗糖梯度离心分离膜组分和胞质组分，免疫荧光观察蛋白定位;构建 CAV1⁺/⁻和 Cavin-1⁺/⁻双杂合小鼠，检测右心室收缩压(RVSP)、右心室肥厚及肺血管重塑;利用透射电镜观察小窝结构，明确 Cavin-1 对 CAV1/BMPR2 结合及 BMP/Smad 信号(Smad1/5/9 磷酸化)的调控作用。

实验结果

图 1：CAV1 敲除小鼠 PMVECs 中 BMP/Smad 信号减弱

该图揭示 CAV1 对内皮细胞 BMP 信号的必要性：CAV1⁻/⁻小鼠 PAECs 和 PASMCs 的小窝数量显著减少(图 1a);PMVECs 中 Cavin-1 表达降低，BMPR2 表达无变化，但 Smad1/5/9 磷酸化水平显著下降(图 1b);而 PASMCs 中 Smad1/5/9 磷酸化无明显差异(图 1c)，提示 CAV1 deficiency 对 BMP/Smad 信号的抑制作用具有内皮细胞特异性。

图 2：CAV1 沉默减少 hPAECs 中 BMPR2 膜定位及 Smad1/5/9 磷酸化

该图明确 CAV1 对 BMPR2 定位的调控：CAV1 siRNA 转染 hPAECs 后，Smad1/5/9 磷酸化显著降低，BMPR2 总表达无变化(图 2a);膜组分分析显示 BMPR2 膜定位减少，胞质定位增加(图 2b);免疫荧光证实 BMPR2 在细胞膜上的分布显著减少(图 2c)，表明 CAV1 通过维持 BMPR2 膜定位调控 BMP/Smad 信号。

图 3：缺氧增强 Cavin-1/CAV1 相互作用，抑制 CAV1/BMPR2 结合

该图阐明缺氧的调控作用：缺氧处理 hPAECs 后，BMPR2 膜定位减少、胞质定位增加，CAV1 和 Cavin-1 膜定位无变化(图 3a);免疫荧光显示缺氧下 CAV1 膜定位维持，BMPR2 膜定位降低(图 3b);PLA 结果显示，缺氧增强 Cavin-1 与 CAV1 的相互作用，同时抑制 CAV1 与 BMPR2 的结合(图 3c)，提示缺氧通过调控蛋白相互作用干扰 BMP 信号。

图 4：Cavin-1 与 BMPR2 竞争性结合 CAV1 的脚手架结构域(CSD)

该图揭示核心结合机制：免疫沉淀显示 Cavin-1 过表达抑制 CAV1 与 BMPR2 的相互作用(图 4a);免疫荧光和 PLA 证实 Cavin-1 过表达减少 BMPR2 膜定位及与 CAV1 的共定位(图 4b-c);GST pulldown 和缺失突变实验表明，CAV1 的 61-101 片段(含 CSD 结构域)是与 Cavin-1 和 BMPR2 结合的关键区域(图 4d-e);竞争性结合实验证实，Cavin-1 与 BMPR2 竞争结合 CAV1 的 CSD 结构域(图 4f-g)。

图 5：Cavin-1沉默挽救CAV1沉默导致的 BMPR2 膜定位及 Smad 信号减弱

该图验证 Cavin-1 的负向调控作用：CAV1 沉默导致 hPAECs 中 BMPR2 膜定位减少，而同时沉默 Cavin-1 可恢复 BMPR2 膜定位(图 5a-b);Western blot 显示，CAV1 沉默降低 Smad1/5/9 磷酸化，Cavin-1 沉默可逆转这一效应(图 5c)，表明 Cavin-1 是 CAV1/BMPR2/BMP/Smad 通路的关键负调控因子。

图 6：CAV1⁺/⁻/Cavin-1⁺/⁻双杂合小鼠抵抗 CAV1 诱导的 PAH

该图证实体内干预效果：CAV1⁺/⁻小鼠肺组织中 CAV1 表达降低，Cavin-1 表达无变化;CAV1⁺/⁻/Cavin-1⁺/⁻小鼠中 Cavin-1 表达显著降低，CAV1 表达维持(图 6a);两组小鼠小窝数量均少于野生型，大小无差异(图 6b);CAV1⁺/⁻小鼠 RVSP 升高、右心室肥厚及肺血管重塑，而 CAV1⁺/⁻/Cavin-1⁺/⁻小鼠上述 PAH 表型显著改善(图 6c-e);PMVECs 中 Smad1/5/9 磷酸化在 CAV1⁺/⁻小鼠中降低，在双杂合小鼠中恢复(图 6f)。

图 7：工作模型

该图总结核心机制：Cavin-1 与 BMPR2 竞争性结合 CAV1 的 CSD 结构域，抑制 BMPR2 膜定位，减弱 BMP/Smad 信号(Smad1/5/9 磷酸化)，促进肺血管重塑和 PAH;沉默 Cavin-1 可解除这一抑制，恢复 BMP/Smad 信号，改善 PAH(图 7)。

研究结论

本研究成功构建了 BTV-1/4/8 血清型 NLuc 报告病毒，建立的 NLuc-based 中和试验具有三大优势：1. 快速高效：48 小时出结果，较传统 SNT 缩短 2-3 天，无需固定染色;2. 精准特异：与传统 SNT 强相关(r≥0.8070)，保持严格血清型特异性;3. 多功能性：既可定量自然感染 / 疫苗免疫动物的 NAbs，也能快速筛选抗病毒药物(如 ATA)。该方法解决了传统中和试验的痛点，为 BTV 流行病学监测、疫苗效力评估及抗病毒研发提供了高效工具，对蓝舌病防控具有重要实用价值。