猪骨髓原代（PBMP）细胞培养方案：高效分离非洲猪瘟病毒（ASFV）的新型工具

非洲猪瘟病毒(ASFV)可致家猪 100% 死亡，其分离是病毒分型、诊断及机制研究的核心步骤。传统依赖的猪外周血单核细胞(PBMC)、肺泡巨噬细胞(PAMC)制备耗时且污染风险高，MA-104 细胞对低载量野毒及新基因型不敏感。俄罗斯联邦动物健康中心 Olga Puzankova 团队在《Methods Protoc.》(2023, 6:73)发表优化方案：以 4-6 周龄健康仔猪管状骨为材料，制备猪骨髓原代(PBMP)细胞，该细胞对 ASFV 敏感性高、污染率低，为 ASFV 高效分离提供可靠工具。

本研究旨在建立简单高效、低污染的 PBMP 细胞培养 protocol，解决传统 ASFV 分离细胞的技术瓶颈。方法：取 ASF 阴性仔猪管状骨，经消毒、切割、摇床洗脱骨髓细胞，梯度过滤纯化后培养;接种 ASFV 样本，通过 “血吸附现象” 鉴定病毒。结果：PBMP 细胞纯度 > 90%(以巨噬细胞为主)，对 ASFV I/II/V 型均敏感，污染率 < 5%。结论：该方案适合 ASFV 分离、滴度测定及新基因型鉴定，推动 ASFV 实验室诊断标准化。

研究背景

ASFV 是唯一的 Asfarviridae 科病毒，基因组为 170-197kbp 双链 DNA，已演化出 24 个基因型及重组型(如中国报道的 I/II 型重组株)，对全球养猪业构成毁灭性威胁。实验室确诊 ASFV 需遵循 “RT-PCR 检测 + 病毒分离” 的双重标准，但传统细胞模型存在显著局限：一是 PBMC/PAMC 依赖新鲜仔猪组织，PBMC 产量低、PAMC 易受真菌污染，难以标准化;二是 MA-104 连续细胞系对低载量野毒敏感性差，且未验证对新基因型(如重组株)的适用性;三是 ASFV 天然宿主为巨噬细胞，现有巨噬细胞来源细胞制备难度高。本研究发现，猪骨髓是巨噬细胞的丰富来源，PBMP 细胞既能保留巨噬细胞对 ASFV 的高敏感性，又可通过标准化流程批量获取，污染风险低，填补了传统方法的空白。

实验方法

实验材料

动物：4-6 周龄健康仔猪(8-15kg，ASF / 猪瘟阴性)，检疫观察 1 周后剖检(符合 BSL-3 规范，动物伦理审批通过);

关键试剂：

清洗缓冲液：生理盐水 + 1.6mg/mL 庆大霉素 + 0.1% 链霉素 + 10³U 青霉素(现配现用);

生长培养基：Minimum Essential Medium(MEM)+0.25% 水解乳清蛋白 + 15% 胎牛血清(FBS)+0.08mg/mL 庆大霉素;

维持培养基：MEM+0.25% 水解乳清蛋白 + 5% FBS+0.08mg/mL 庆大霉素;

设备：II 级生物安全柜、37℃ 5% CO₂培养箱、摇床(250rpm)、台式离心机(1400rpm)、Countess™自动细胞计数仪、倒置显微镜。

PBMP 细胞制备步骤

管状骨处理：剖检获取肱骨、股骨、胫骨等管状骨，70% 乙醇浸泡后置于摇床(250rpm)消毒 10-15min;用手术刀剥离表面肌肉组织，无菌剪将骨骼切割为 2cm³ 小块(暴露骨髓腔);

骨髓细胞洗脱：骨块放入 T-225 培养瓶，按 1:1(m/v)加入清洗缓冲液，室温孵育 2min 后弃液;再按 1:1.5(m/v)加入生理盐水，37℃ 250rpm 摇床孵育 20min，8 层医用纱布过滤收集细胞悬液(可重复洗脱 1 次以提高细胞产量);

细胞纯化与计数：收集的细胞悬液于 4℃、1400rpm 离心 20min，弃上清后用生长培养基重悬沉淀;依次经 8 层纱布、100μm、70μm 滤网过滤，Countess™计数仪调整细胞浓度至 20-30×10⁶ cells/cm³;

培养与维护：按培养瓶规格接种(T-25 瓶加 3-5mL、T-75 瓶加 8-15mL)，37℃ 5% CO₂培养 48h;更换为维持培养基，2-5 天内用于 ASFV 相关实验。

ASFV 分离与鉴定

样本预处理：取疑似 ASFV 感染猪的组织(脾、全血、淋巴结等)，按 1:10(m/v)加入生理盐水匀浆;1100×g 离心 10min，取上清经 0.45μm Millex-HV 滤器过滤;加入庆大霉素(终浓度 0.01%)，37℃孵育 1h 以抑制细菌污染;

病毒接种与培养：将预处理样本接种至 PBMP 细胞培养体系，37℃ 5% CO₂培养箱孵育 7 天;

结果判定：接种后 15-18h 首次用 10×10 倍显微镜观察，之后每日观察 “血吸附现象”(红细胞附着于病毒感染细胞表面);7 天内出现血吸附判定为 ASFV 阳性;无血吸附需连续传代 2 次，仍无阳性信号则结合 RT-PCR 检测确认(排除病毒失活)。

实验结果

Fig1：PBMP 细胞制备的管状骨选择与预处理

左图为猪骨骼示意图，明确标注用于取材的管状骨(肱骨、股骨、胫骨等)—— 这些骨骼骨髓腔容积大、骨髓含量高，是 PBMP 细胞的最优来源;右图为剥离表面肌肉后的管状骨，骨骼结构完整无残留组织，为后续消毒、切割及骨髓洗脱奠定基础。此步骤通过 “精准选骨 + 彻底去肌肉”，从源头保障骨髓细胞纯度，降低后续污染风险。

Fig2：管状骨切割与接种培养

左图展示无菌剪将管状骨切割为 2cm³ 小块的操作，目的是最大化暴露骨髓腔，确保后续生理盐水能充分接触并洗脱骨髓细胞;右图为切割后的骨块均匀铺于 T-225 培养瓶的状态 —— 大容积培养瓶可避免骨块堆积，保障洗脱液与骨髓腔的充分接触，实验证实该操作可使骨髓细胞洗脱效率提升 30%，同时避免骨块过小导致的组织碎片污染。

Fig3：PBMP 细胞形态特征(培养 48h 后)

20×(左图)和 40×(右图)显微镜下，PBMP 细胞以巨噬细胞为主，呈圆形或椭圆形(直径 40-60μm)，细胞表面光滑、均匀贴附于培养瓶底(蓝色箭头标注巨噬细胞)，仅少量红细胞残留(红色箭头);细胞无团聚现象，无梭形成纤维细胞(排除杂细胞污染)，纯度 > 90%，完全符合 ASFV 感染所需的巨噬细胞模型特征。若细胞出现贴壁差或团聚，需排查滤网孔径(确保 70μm 过滤)或培养基新鲜度。

Fig4：ASFV 感染后的血吸附现象

该图为 ASFV-Arm07 株(II 型)感染 PBMP 细胞 48h 后的观察结果(10×-60× 放大)：可见大量红细胞特异性附着于感染细胞表面，形成明显 “血吸附斑”—— 这是 ASFV 感染巨噬细胞的特异性生物学标志(未感染细胞无此现象)。实验验证，PBMP 细胞对 ASFV I 型(Lisbon 60)、II 型(Arm07)、V 型(Mozambique-78)及俄罗斯多地分离的 II 型野毒均能高效支持感染，对低载量野毒的阳性检出率比 MA-104 细胞高 40%。

研究结论

本研究建立的 PBMP 细胞培养方案具有三大核心优势：一是高敏感性，可高效分离 ASFV 多基因型(I/II/V 型)及低载量野毒，解决 MA-104 细胞的局限;二是低污染风险，通过乙醇消毒、梯度过滤及抗生素处理，细菌 / 真菌污染率 < 5%，显著优于 PAMC;三是高可操作性，无需流式细胞仪等复杂设备，骨髓洗脱步骤简单，适合不同规模实验室推广。该方案不仅可用于 ASFV 分离与滴度测定，还能支持病毒基因组测序(T-75 瓶批量扩毒)，为 ASFV 的诊断、分型及致病机制研究提供关键细胞模型，对全球 ASF 防控具有重要应用价值。