抗炎药物新突破！BET/HDAC 抑制剂双管齐下

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：High-Throughput Screening for CEBPD-Modulating Compounds in THP-1-Derived Reporter Macrophages Identifies Anti-Inflammatory HDAC and BET Inhibitors

中文标题：高通量筛选鉴定 CEBPD 调控化合物：抗炎 HDAC 与 BET 抑制剂的发现

发表期刊：《Internationaljournal of Molecular Sciences》

影响因子：4.9

作者单位：

1.Fraunhofer Institute for Translational Medicine and Pharmacology ITMP, Theodor-Stern-Kai 7, 60596 Frankfurt am Main, Germany

2.Fraunhofer Institute for Translational Medicine and Pharmacology ITMP, Schnackenburgallee 114, 22525 Hamburg, Germany

3.EpiEndo Pharmaceuticals ehf, Eiðistorg 13-15, 170 Seltjarnarnes, Iceland

作者信息：

Tatjana Ullmann¹*, Sonja Luckhardt¹, Markus Wolf², Michael J. Parnham¹,³, Eduard Resch¹*

研究背景

CCAAT / 增强子结合蛋白 δ(CEBPD)是巨噬细胞炎症反应的核心转录因子，通过调控炎症基因转录参与类风湿关节炎、动脉粥样硬化等疾病进程。现有抗炎药物(如甾体、非甾体抗炎药)存在胃肠道损伤、免疫抑制等副作用，亟需开发靶向 CEBPD 的新型精准抗炎化合物。本研究构建 THP-1 来源的 CEBPD 报告基因巨噬细胞模型，高通量筛选化合物库，鉴定调控 CEBPD 活性的表观遗传抑制剂，为炎症驱动疾病提供新治疗方向。

实验方法

本研究首先通过病毒转导技术构建 THP-1 来源的 CEBPD::SEAP 报告基因细胞系，将分泌型碱性磷酸酶(SEAP)基因置于 CEBPD 启动子调控下，以 SEAP 活性反映 CEBPD 转录活性;随后采用包含 1280 个药理活性化合物的 LOPAC®1280 库和 774 个 FDA 批准药物的 ENZO®774 库，建立 “化合物预处理 1 小时→LPS(0.1μg/mL)+IFN-γ(20ng/mL)刺激 24 小时→检测 SEAP 酶活性” 的高通量筛选流程，同时设置 M0 对照组(未刺激)、M1 溶剂对照组(DMSO)及 M1 TSA 对照组(已知 HDAC 抑制剂)以排除干扰;通过 RT-qPCR 检测化合物对报告基因 CEBPD::SEAP、内源性 CEBPD 及炎症相关基因(IL-6、CCL2、IL-1β)mRNA 表达的影响，利用 CellTiter-Glo® 实验验证细胞活力以排除毒性干扰，借助 Western blot 初步探索 PI3K-AKT/TGF-β 信号通路在化合物调控 CEBPD 中的潜在作用，最终通过两次重复筛选确认 hit 化合物的可靠性。

实验结果

图 1：SEAP 报告基因检测系统的性能验证

该图确认检测系统的可靠性：HEK293T 细胞中，CMV 启动子驱动的 SEAP 可稳定分泌，其酶活性在 10⁴倍稀释范围内呈严格线性关系(R²=0.99)，覆盖从低到高的广泛检测范围(图 1b);Z’因子达 0.7(理想值≥0.5)， intra-assay CV(批内变异)<10%、inter-assay CV(批间变异)<5%(表 1)，表明系统灵敏度高、重复性好，可满足高通量筛选对稳定性和准确性的要求(图 1c)。

图 2：THP-1::CEBPD::SEAP 报告基因巨噬细胞系的有效性验证

该图证实细胞系能准确反映 CEBPD 活性：PMA(50ng/mL)处理 48h 可诱导 THP-1 报告细胞分化为贴壁巨噬细胞，分化过程中 CEBPD 启动子激活，SEAP 分泌量显著升高(图 2c);LPS(0.1/1μg/mL)+IFN-γ(20ng/mL)刺激可剂量依赖性上调内源性 CEBPD mRNA 表达，6h 时达峰值(最高 4.5 倍)(图 2d);报告基因 CEBPD::SEAP 的 mRNA 表达趋势与内源性 CEBPD 完全一致，且 SEAP 酶活性在刺激后 24h 达最高值(图 2e-f)，说明该细胞系可精准模拟内源性 CEBPD 的转录调控，适合筛选 CEBPD 调控化合物。

图 3：高通量筛选流程及 hit 化合物鉴定

该图展示筛选策略与核心结果：建立标准化高通量筛选方案(图 3a)，将化合物分为 “M0 对照组(未刺激)、M1 溶剂对照组(DMSO)、M1 TSA 对照组(已知 HDAC 抑制剂)、化合物处理组”，通过两次重复筛选排除假阳性;以 “SEAP 活性高于 M1 溶剂对照组 3 个标准差(3×SD)” 为 hit 判定标准，从 2054 个化合物中鉴定出 3 个核心 hit(I-BET151、Ro 11-1464、SAHA)，并纳入已知 HDAC 抑制剂 TSA(图 3b-c);细胞活力实验显示，这些化合物的 SEAP 活性提升与细胞增殖 / 存活无关，排除细胞毒性或促增殖作用对结果的干扰。

图 4：BET 抑制剂 I-BET151 对 SEAP 分泌及基因表达的影响

该图聚焦 I-BET151 的调控效应：10μM I-BET151 预处理可显著提升 LPS+IFN-γ 刺激后的 SEAP 酶活性(图 4a);基因表达层面，I-BET151 显著上调报告基因 CEBPD::SEAP(9.6 倍)和内源性 CEBPD(7.5 倍)的 mRNA 表达(图 4b-c、表 2);抗炎效果上，I-BET151 强效抑制 IL-6(从 6625 倍降至 102.3 倍，抑制 65 倍)和 CCL2(从 187.7 倍降至 11.5 倍，抑制 15 倍)的 mRNA 表达(图 4d-e、表 2);但同时上调 IL-1β 表达(从 396 倍升至 927.1 倍，增加 2.3 倍)，显示其兼具抗炎与轻微促炎的双向作用(图 4f、表 2)。

图5：BET 抑制剂 Ro 11-1464 对 SEAP 分泌及基因表达的影响

该图揭示Ro 11-1464 的特异性调控：10μM Ro 11-1464 预处理可显著升高 SEAP 酶活性，且效果具有统计学意义(p<0.001)(图 5a);与 I-BET151 类似，Ro 11-1464 可上调报告基因 CEBPD::SEAP(8.8 倍)和内源性 CEBPD(12.4 倍)的 mRNA 表达(图 5b-c、表 3);抗炎方面，Ro 11-1464 抑制 IL-6(从 12432 倍降至 1364 倍，抑制 9 倍)和 CCL2(从 237.2 倍降至 26.6 倍，抑制 9 倍)表达(图 5d-e、表 3);但与 I-BET151 不同，Ro 11-1464 对 IL-1β mRNA 表达无显著影响(344.8 倍 vs 445.3 倍，p>0.05)，提示不同 BET 抑制剂对 IL-1β 的调控存在差异(图 5f、表 3)。

图 6：HDAC 抑制剂 SAHA 和 TSA 对 SEAP 分泌及基因表达的影响

该图展现 HDAC 抑制剂的独特调控模式：10μM SAHA 或 0.5μM TSA 预处理后，SEAP 酶活性显著升高(图 6a);但基因表达呈现 “双向差异”—— 报告基因 CEBPD::SEAP 的 mRNA 表达显著上调(SAHA 组 6.4 倍，TSA 组 6.8 倍)，而内源性 CEBPD 的 mRNA 表达被完全抑制(接近 M0 对照组水平，表 4)(图 6b-c);抗炎效果上，SAHA 和 TSA 均强效抑制 IL-6(SAHA 抑制 110 倍，TSA 抑制 130 倍)和 CCL2(均抑制 15 倍以上)表达(图 6d-e、表 4);同时轻微上调 IL-1β 表达(SAHA 组 492.5 倍，TSA 组 501.9 倍)，但幅度低于 I-BET151(图 6f、表 4)，这种 “报告基因与内源性 CEBPD 调控相反” 的现象，推测与 HDAC 抑制剂对 CEBPD 启动子的顺式激活(报告基因仅含近端 332bp 启动子)和反式抑制(内源性基因含远端调控区域)的平衡差异有关

研究结论

本研究通过高通量筛选从 2054 个化合物中鉴定出 4 种可调控 CEBPD 活性的抗炎化合物，包括 2 种 BET 抑制剂(I-BET151、Ro 11-1464)和 2 种 HDAC 抑制剂(SAHA、TSA);其中 BET 抑制剂可显著上调内源性 CEBPD 及报告基因 CEBPD::SEAP 的 mRNA 表达，强效抑制 IL-6 和 CCL2(I-BET151 分别抑制 65 倍、15 倍，Ro 11-1464 均抑制 9 倍)，且 Ro 11-1464 对 IL-1β 无显著影响，安全性更优;HDAC 抑制剂虽抑制内源性 CEBPD，但可上调报告基因 CEBPD::SEAP(推测与报告基因仅含 CEBPD 近端启动子、内源性基因含远端调控区域有关)，且抑制 IL-6/CCL2 效率更高(SAHA 抑制 110 倍、15 倍以上，TSA 抑制 130 倍、17 倍以上);所有化合物均无显著细胞毒性，不仅为类风湿关节炎、动脉粥样硬化等炎症驱动疾病提供了 4 种新型候选药物，还揭示了 BET/HDAC 介导的 CEBPD 表观遗传调控差异，为后续靶向 CEBPD 的精准抗炎治疗提供了实验基础和机制参考。