星形胶质细胞通过 Cx47/Chi3l1 轴促进少突胶质前体细胞增殖的机制研究

重庆医科大学组织胚胎学教研室、干细胞与组织工程实验室及第一附属医院神经外科团队 2019 年发表于《European Review for Medical and Pharmacological Sciences》的研究，通过原代细胞培养、Cx47 干扰及外源性蛋白处理实验，证实星形胶质细胞(ASTs)可通过上调少突胶质前体细胞(OPCs)中缝隙连接蛋白 47(Cx47)的表达，激活 Chi3l1(几丁质酶 3 样蛋白 1)的表达，进而上调 Cyclin D1 调控 OPCs 细胞周期，最终促进其增殖。该研究为阿尔茨海默病、多发性硬化症等脱髓鞘神经退行性疾病的治疗提供了新分子靶点。

研究背景

脱髓鞘神经退行性疾病(如阿尔茨海默病 AD、多发性硬化症 MS)严重威胁老年人健康，髓鞘再生依赖少突胶质前体细胞(OPCs)的增殖与分化 —— 而 OPCs 是中枢神经系统(CNS)中唯一能分化为成熟少突胶质细胞(OLs，形成髓鞘的细胞)的前体细胞。星形胶质细胞(ASTs)作为 CNS 中数量最多的胶质细胞，可通过分泌细胞因子或缝隙连接(GJ)传递信号，调控 OPCs 的生长发育，但具体机制尚未完全明确。

缝隙连接由 connexin(Cx)蛋白构成，OPCs 主要表达 Cx47、Cx32 等，ASTs 主要表达 Cx43、Cx30 等，其中 Cx47 对 OPCs 稳定表达及髓鞘完整性至关重要，其下调会导致脱髓鞘疾病(如 MS)。Chi3l1 是一种促肿瘤细胞增殖的细胞因子，此前未报道其在 OPCs 增殖中的作用。本研究旨在探究 ASTs 是否通过 Cx47 调控 Chi3l1，进而影响 OPCs 增殖，填补该机制空白。

实验方法(技术流程与检测手段)

1. 核心材料与样本

样本来源：新生 SD 大鼠(P0-P3，重庆医科大学实验动物中心)，动物饲养符合国家标准，实验经伦理委员会批准;

细胞与试剂：神经母细胞瘤细胞系 B104(陆军军医大学馈赠)、DMEM/F12 培养基、N-2 添加剂、胎牛血清(FBS)、Cx47 抗体(BS7447)、Chi3l1 抗体(sc-393484)、Cyclin D1 抗体(bs-20596R)、重组 Chi3l1 蛋白(RPB463Ra01)、EdU 试剂盒(RiboBio)、Cx47 siRNA(序列：CCGAGAAGACTGTCTTCTT)、RT-PCR 试剂盒(TaKaRa);

关键工具：流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、Western blot 成像系统、荧光显微镜。

2. 关键实验步骤

细胞培养：

OPCs 原代培养：分离 SD 大鼠端脑组织，用含 12% FBS 的培养基培养 4 天后，换用含 1% N-2+20% B104 细胞上清的培养基，培养 7-9 天，EDTA 消化纯化;

ASTs 原代培养：大鼠脑组织胰酶消化后，37℃孵育 20 分钟，取上清接种于多聚赖氨酸(PDL)包被培养皿，含 12% FBS 培养基培养 3-4 天;

共培养：ASTs 与 OPCs 接种于同一培养皿，用含 20% B104 上清 + 1% N-2 的培养基培养 3-4 天。

实验分组：

A 组：ASTs 与 OPCs 直接接触共培养;

O 组：OPCs 单独培养;

Cx47si 组：共培养体系中干扰 OPCs 的 Cx47;

NCsi 组：共培养体系中空白干扰;

5ng/ml 组 / 10ng/ml 组：OPCs 单独培养时加入对应浓度外源性 Chi3l1。

检测方法：

增殖检测：EdU 标记(荧光显微镜计数阳性细胞)、流式细胞术分析细胞周期(75% 乙醇固定，检测 S 期比例);

分子检测：RT-PCR 测 Cx47 mRNA(引物：Cx47 上游 GAGGATGAGGACGAGGAACCA，下游 CTCCTACTCCTGCTCCTTGGT)、Western blot 测 Cx47/Chi3l1/Cyclin D1 蛋白(GAPDH 内参)、免疫荧光(DAPI 染核，特异性抗体标记目标蛋白，共聚焦成像);

统计分析：SPSS17.0，单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

Figure 1：AST-OPC 共培养促进 OPCs 中 Cx47 表达

Western blot 结果显示，OPCs 单独培养(O 组)的 Cx47 蛋白表达(0.68±0.08)显著低于 AST-OPC 共培养(A 组)(1.05±0.09，P<0.05);RT-PCR 结果显示，O 组 Cx47 mRNA 表达(2.2±0.58)显著低于 A 组(15.3±2.40，P<0.01)，证实 ASTs 可通过直接接触共培养，显著上调 OPCs 中 Cx47 的转录与蛋白表达。

Figure 2：Cx47 干扰后 OPCs 增殖能力下降

Western blot 与免疫荧光证实 Cx47si 组的 Cx47 表达(蛋白：0.456±0.207;荧光强度：254.12±53.93)显著低于 NCsi 组(蛋白：1.046±0.163;荧光强度：881.35±263.97，P<0.01)，干扰成功;流式细胞术显示，Cx47si 组 OPCs 的 S 期比例(7.44±1.10%)显著低于 A 组(17.35±2.03%)与 NCsi 组(14.85±1.92%，P<0.05);EdU 检测显示，Cx47si 组新生细胞比例(28.4±6.6%)显著低于 A 组(48.7±3.8%)与 NCsi 组(47.8±5.1%，P<0.05)，表明 Cx47 是 ASTs 促进 OPCs 增殖的关键分子。

Figure 3：Cx47 干扰后 OPCs 中 Chi3l1 表达降低

Western blot 结果显示，Cx47si 组 Chi3l1 蛋白表达(0.30±0.08)显著低于 A 组(1.10±0.91)与 NCsi 组(1.03±0.27，P<0.05);免疫荧光显示，Cx47si 组 Chi3l1 红色荧光强度(407.33±106.84)显著低于 A 组(1081.54±327.25)与 NCsi 组(1282.33±381.64)，且 Chi3l1 与 OPCs 特异性标志物 PDGFαR 共定位，证实 Cx47 可调控 OPCs 中 Chi3l1 的表达，Chi3l1 是 Cx47 下游分子。

Figure 4：外源性 Chi3l1 促进 OPCs 增殖并上调 Cyclin D1

流式细胞术显示，OPCs 单独培养时，加入 5ng/ml(10.63±2.33%)、10ng/ml(13.55±1.60%)Chi3l1 后，S 期比例显著高于 O 组(7.37±1.38%，P<0.01);EdU 检测显示，5ng/ml 组(31.08±3.44%)、10ng/ml 组(45.32±1.74%)新生细胞比例显著高于 O 组(22.92±2.90%，P<0.01)，且呈浓度依赖性;Western blot 显示，10ng/ml 组 Cyclin D1 蛋白表达(1.16±0.14)显著高于 O 组(0.68±0.09，P<0.01)，证实外源性 Chi3l1 可通过上调 Cyclin D1，促进 OPCs 进入 S 期，增强其增殖能力。

研究结论

星形胶质细胞(ASTs)通过直接接触共培养，显著上调少突胶质前体细胞(OPCs)中缝隙连接蛋白 47(Cx47)的表达;Cx47 进一步激活 OPCs 中 Chi3l1 的表达，上调细胞周期蛋白 Cyclin D1，促进 OPCs 从 G1 期进入 S 期，最终增强其增殖能力。该研究明确了 “ASTs-Cx47-Chi3l1-Cyclin D1” 调控轴在 OPCs 增殖中的关键作用，为 AD、MS 等脱髓鞘神经退行性疾病的髓鞘再生治疗提供了新分子靶点。