新型肝脏培养系统问世！四细胞共培养 + 临床仪器，精准复现体内代谢，破解毒理学评估难题

传统肝脏体外模型因缺乏细胞互作、细胞密度不足或与临床检测脱节，难以精准模拟体内生理功能，导致毒理学评估准确性受限。来自斯洛文尼亚马里博尔大学医学部的 Eneko Madorran 团队(通讯作者：eneko.madorran@um.si)在《Current Protocols》(2025, 5:e70172)发表研究，构建了一种新型肝脏细胞培养系统：以 96 孔板为载体，共培养肝细胞(Hepatocytes)与肝脏非实质细胞(NPCs，含肝血窦内皮细胞、肝星状细胞、库普弗细胞)，并整合临床生化分析仪(Cobas C111)和膜电位细胞活力检测(MPCVA)技术。该系统可复现体内葡萄糖 - 甘油三酯动态平衡，精准响应布洛芬(IBU)、利福平(RIF)等肝毒性药物的生理效应，显著提升肝脏模型的生理相关性与转化潜力，为肝脏(病理)生理研究及毒理学评估提供了可靠工具。

本研究旨在解决传统肝脏体外模型与体内微环境差异大、基础研究与临床应用脱节的问题，建立一种能精准模拟体内肝脏功能的新型培养系统。

方法包括：

1. 配制含脂肪酸、维生素和氨基酸的专用 Hep 培养基，支持多细胞共培养;

2. 采用 96 孔板共培养肝细胞与 NPCs，构建多细胞互作微环境;

3. 利用 Cobas C111 临床生化分析仪检测葡萄糖、甘油三酯、白蛋白等临床相关 biomarkers;

4. 通过 MPCVA 方法结合 ImageStream 成像流式细胞仪(ISX)评估细胞活力与周期。

结果显示，该系统可形成类肝脏小叶结构，复现体内代谢动态，且能特异性响应肝毒性药物，biomarkers 水平与临床诊断标准一致，为肝脏转化研究搭建了 “基础 - 临床” 桥梁。

研究背景

肝脏作为代谢与毒理学评估的核心器官，其体外模型需精准复现细胞互作、代谢通路及生理响应。然而，现有模型存在显著局限：2D 肝细胞模型虽用原代细胞(“金标准”)，但寿命短且缺乏非实质细胞，无法模拟细胞间调控;肝脏器官芯片(OOC)虽能模拟微环境，但细胞数量少、密度低，与体内状态差距大; spheroid 模型细胞量多于 OOC，但核心细胞易因营养不足失活，且整体密度仍低于天然肝脏。

更关键的是，基础研究聚焦分子机制(如葡萄糖代谢通路)，而临床研究关注生理指标(如血糖水平)，这种目标与方法的脱节导致预临床数据难以转化。本研究通过整合多细胞共培养与临床仪器，首次实现 “体外模型 biomarkers 与临床诊断标准对齐”，填补了传统模型的转化空白。

实验结果

图 1：新型肝脏细胞培养系统实验流程

该图展示从细胞准备到功能分析的完整流程：1. 分别培养原代肝细胞与 NPCs(非实质细胞);2. 消化后按比例(肝细胞：NPCs=4:1)接种于 96 孔板共培养;3. 倒置显微镜观察细胞形态与自组装结构;4. 收集上清用 Cobas C111 检测生化指标;5. 采用 MPCVA 方法结合 ISX 评估细胞活力。流程设计核心是通过 “单独培养 - 共培养 - 双维度检测(形态 + 生化)”，确保模型的结构与功能一致性。

图 2：NPCs 在 Hep 培养基中形成小叶样结构

该图显示 NPCs 的培养特征：NPCs 在 Hep 培养基中培养 7 天后，可自发形成类似体内肝脏的小叶样结构(lobule-like structures)，倒置显微镜下可见细胞有序排列，无明显团聚或凋亡。这一结构是肝脏微环境的关键特征，为后续与肝细胞共培养奠定了 “结构基础”，且无需额外添加细胞外基质(ECM)—— 研究证实肝星状细胞可自主合成足量 ECM，外源性 ECM 反而可能干扰细胞天然生化过程。

图 3：肝细胞与 NPCs 共培养的自组装结构

该图展示共培养体系的细胞排列：肝细胞与 NPCs 接种后，可自主组装为类似体内肝脏的结构化布局(structured arrangements)，而非随机分布。这种自组装依赖细胞间信号互作(如 NPCs 分泌的细胞因子调控肝细胞极性)，是模型能复现体内代谢功能的核心前提。研究指出，若细胞未形成该结构，可能导致葡萄糖 - 甘油三酯动态平衡异常，需调整培养基中脂肪酸浓度或细胞接种比例。

图 4-6：Cobas C111 生化分析仪的样本处理与结果

这组图展示临床生化检测的关键步骤与数据：

Fig.4：Cobas C111 的样本识别界面，需手动录入样本信息(如 “未处理组”“RIF 处理组”)，确保检测结果与实验组对应;

Fig.5：检测项目选择界面，需勾选 ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、GLU(葡萄糖)、TRIGL(甘油三酯)等肝脏特异性指标，这些指标与临床肝功能诊断完全一致;

Fig.6：典型检测结果，健康模型中葡萄糖与甘油三酯呈负相关(符合体内肝脏代谢规律)，而 RIF 处理组甘油三酯显著升高、葡萄糖降低，IBU 处理组则出现 GLU 代谢异常，与体内肝毒性反应一致。

图 7：MPCVA 方法的细胞活力评估结果

该图展示细胞活力检测的判定标准：通过 FluoVolt(膜电位染料，FITC 通道)与 Vybrant(DNA 染料，Texas Red 通道)双染色，结合 ISX 分析：

活细胞判定：FITC 强度 / 细胞大小处于 2.5%-97.5% 分位数之间，且 Texas Red 强度低于 G2/M 期阈值;

死细胞判定：FITC 强度 / 细胞大小低于 2.5% 分位数(低膜电位)，或高于 97.5% 分位数且低于 G2/M 期阈值(异常膜电位)。

该方法较传统 MTT 法假阳性率更低，能更精准反映肝毒性药物对细胞活力的影响 —— 如 5 - 氟尿嘧啶(5-FU)处理组死细胞比例达 40% 以上，而未处理组仅 5% 左右。

图 8：基于 DNA 染色的细胞周期分析

该图展示细胞周期的流式检测结果：采用膜渗透性 DNA 染料染色后，ISX 可识别 G0/G1 期(低荧光强度，DNA 含量 2n)、S 期(中荧光强度，DNA 复制中)、G2/M 期(高荧光强度，DNA 含量 4n)三个峰。研究指出，肝毒性药物(如 RIF)会导致 G2/M 期细胞比例升高(约 18% vs 未处理组 10%)，提示药物干扰细胞分裂，这一结果需结合 MPCVA 活力数据综合解读 —— 避免将 “周期阻滞细胞” 误判为活细胞。

研究结论

本研究构建的新型肝脏细胞培养系统具有三大核心优势：1. 结构生理化：通过肝细胞与 NPCs 共培养，自发形成类体内小叶结构，无需外源性 ECM;2. 功能临床化：整合 Cobas C111 分析仪，biomarkers(如 GLU、TRIGL)与临床诊断标准一致，解决基础 - 临床脱节问题;3. 应用广泛化：可用于健康肝脏模拟、肝毒性药物筛选(如 IBU、RIF)及 NAFLD/NASH 等病理模型构建(未来拓展方向)。

该系统操作标准化(全程约 1 周)，成本可控，可在 96 孔板中实现高通量检测，为肝脏(病理)生理机制研究、药物毒理学评估及转化医学研究提供了可靠且实用的体外模型。