57 nm 光谱分离！高灵敏度mNG-p2/p7-NLuc报告基因，助力抗病毒药物研发

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：A Highly Sensitive BRET-Based Reporter for Live-Cell Detection of HIV-1 Protease Activity and Inhibitor Screening

中文标题：基于 BRET 的新型活细胞报告基因：高灵敏度检测 HIV-1 蛋白酶活性及抑制剂筛选

发表期刊：《Viruses》

影响因子：3.5

作者单位：

1. Department of Molecular Medicine, University of Padua, 35121 Padova, Italy.

2. Current address: Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences, University of Milan, 20133 Milano, Italy.

作者信息：

Matteo Centazzo†,§, Atalie Verra-Victoria Djossou‡,§, Silvia Pavan, Gualtiero Alvisi*

研究背景

HIV-1 蛋白酶(PR)是抗病毒治疗的关键靶点，但其体外筛选抑制剂的实验无法兼顾细胞通透性、毒性及化合物胞内激活需求。生物发光共振能量转移(BRET)技术适合活细胞检测，但传统 YFP-RLuc 报告基因存在信号背景高、光谱重叠严重等缺陷。本研究开发两种 BRET 报告基因(YFP-p2/p7-RLuc 和 mNG-p2/p7-NLuc)，以 HIV-1 p2/p7 为切割位点，对比新型 NanoLuc/mNeonGreen(mNG)对与传统 RLuc/YFP 对的性能，旨在提供高灵敏度、双读数(PR 活性+细胞活力)的活细胞筛选工具。

研究方法

报告基因构建：构建两种报告基因，荧光受体(YFP/mNG)与生物发光供体(RLuc/NLuc)通过 HIV-1 p2/p7 切割位点连接，同时构建无切割位点的对照载体。

细胞实验：HEK293T 细胞培养并共转染报告基因与 HIV-1 PR(或催化失活突变体 D25N)，Western blot 验证报告基因切割;光谱测量分析供体 / 受体发射特性。

BRET 实验：添加底物 h-CTZ 后，检测 460±25 nm(供体)和 535±25 nm(受体)发射信号，计算 BRET 比值。

抑制剂筛选与 IC₅₀计算：测试洛匹那韦、利托那韦等 HIV-1 PR 抑制剂及其他病毒蛋白酶抑制剂，通过 BRET 比值变化筛选特异性抑制剂，拟合剂量 - 反应曲线计算 IC₅₀;mNG 荧光同步监测细胞活力。

统计分析：使用 GraphPad Prism 9 进行 ANOVA 和非线性回归分析，p<0.05 为显著。

实验结果

图1：BRET 报告基因的设计与光谱特性

该图展示核心设计：报告基因在无 PR 时供体与受体近距离结合，BRET 比值高;PR 切割后两者分离，比值降低(图 1A-B);载体含 Gateway 重组位点，可灵活替换启动子和切割位点(图 1C);mNG-NLuc 对的供体 / 受体发射峰分离达 57 nm，优于 YFP-RLuc 的 46 nm，光谱重叠更少(图 1F-G)。

图2：两种报告基因的性能对比

该图证实 mNG-p2/p7-NLuc 更优：NLuc 的发光强度是 RLuc 的 100 倍(图 2C);无 PR 时，mNG-p2/p7-NLuc 的 BRET 比值(0.91)显著高于 YFP-p2/p7-RLuc(0.62)(图 2E);HIV-1 PR 可剂量依赖性降低两种报告基因的 BRET 比值，但 mNG-p2/p7-NLuc 的降低幅度更大(>90% vs. 约 70%)，且催化失活突变体 D25N 无作用(图 2G-H)。

图3：报告基因的光谱详细分析

该图明确光谱优势：NLuc 发射峰(460 nm)较 RLuc(475 nm)蓝移，在受体发射区间(530 nm)的背景更低(图 3A);mNG 的激发 / 发射光谱与 NLuc 匹配度更高，能量转移效率优于 YFP-RLuc(图 3B-C);PR 切割后，mNG-p2/p7-NLuc 的能量转移抑制更显著(图 3I,K)。

图4：Western blot 验证报告基因切割

该图证实特异性切割：YFP-p2/p7-RLuc(63 kDa)被 PR 切割为 36 kDa 的 RLuc 片段，mNG-p2/p7-NLuc(45 kDa)被切割为 17 kDa 的 NLuc 片段(图 4);添加洛匹那韦或转染 D25N 突变体可阻断切割，无切割位点的对照载体无片段产生。

图5：mNG-p2/p7-NLuc 的剂量依赖性响应

该图显示特异性与灵敏度：HIV-1 PR 质粒用量(0-100 ng)与 BRET 比值呈负相关，100 ng 时比值降低 > 90%，而对照载体 mNG-NLuc 无变化(图 5A,C);mNG 荧光无明显下降，表明无细胞毒性(图 5C);PR 质粒的 EC₅₀为 5 ng(图 5D)。

图6：报告基因用于 HIV-1 PR 抑制剂筛选

该图验证筛选有效性：洛匹那韦、利托那韦等 HIV-1 PR 抑制剂可剂量依赖性恢复 BRET 比值，而 rhinovirus 3CL 抑制剂( rupintrivir)、HCV NS3/4A 抑制剂(simeprevir)等无作用(图 6G-H);mNG 荧光显示，除 rupintrivir 和 tolcapone 外，多数抑制剂在 100 μM 时无明显毒性(图 6A-B)。

图7：抑制剂 IC₅₀值的测定

该图量化抑制剂 potency：洛匹那韦的 IC₅₀最低(270 nM)，其次是沙奎那韦(570 nM)、奈非那韦(1080 nM)和利托那韦(1800 nM)(图 7A-D)，与临床报道的抗病毒活性趋势一致。

研究结论

本研究成功开发了基于 mNG-p2/p7-NLuc 的高灵敏度 BRET 报告基因，相比传统 YFP-RLuc，其具有发光强度高、光谱分离好、背景低等优势。该报告基因可在活细胞中特异性检测 HIV-1 PR 活性，同时通过 mNG 荧光监测细胞活力，实现 “双读数” 分析;能高效筛选特异性 PR 抑制剂并准确计算 IC₅₀值，且载体设计灵活，可替换切割位点适配其他病毒蛋白酶检测。该工具解决了体外筛选的局限性，为 HIV-1 及其他病毒的抗病毒药物高通量研发提供了可靠的活细胞平台。