从实验室到临床：EGFR-STAT3-ABCB1 通路，肝癌耐药的核心靶点与联合治疗新策略

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：Inhibition of EGFR overcomes acquired lenvatinib resistance driven by STAT3-ABCB1 signaling in hepatocellular carcinoma

中文标题：EGFR-STAT3-ABCB1 通路介导肝癌仑伐替尼获得性耐药，厄洛替尼联合治疗可逆转耐药

发表期刊：《Cancer Research》

影响因子：16.6

作者单位：

1. Department of General Surgery, Huashan Hospital & Cancer Metastasis Institute, Fudan University, Shanghai 200040, China.

2. Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China.

3. Phase I Clinical Trial Center, Fudan University Shanghai Cancer Center, Shanghai 200032, China.

作者信息：

Beiyuan Hu¹,²*, Tiantian Zou¹,²*, Wei Qin¹,²*, Xiaotian Shen¹,²*, Yinghan Su¹,², Jianhua Li¹, Yang Chen³, Ze Zhang¹,², Haoting Sun¹,², Yan Zheng¹,², Chao-Qun Wang¹,², Zhengxin Wang¹, Tian-En Li¹,², Shun Wang¹,², Le Zhu¹,², Xufeng Wang¹,², Yan Fu¹,², Xudong Ren¹,², Qiongzhu Dong¹,²#, Lun-Xiu Qin¹,²#

研究背景

仑伐替尼是晚期肝癌(HCC)一线靶向药物，通过抑制 VEGFR、FGFR 等多靶点发挥作用，但 60% 以上患者会在 1 年内出现获得性耐药，严重限制临床获益。既往研究表明，多药耐药转运体(如 ABCB1)介导的药物外排是耐药关键机制，而 EGFR 信号异常激活常参与肿瘤耐药，但二者在仑伐替尼耐药中的关联及调控机制尚未明确。本研究旨在揭示肝癌仑伐替尼耐药的核心通路，开发有效的联合治疗策略。

研究方法

耐药模型建立：通过逐步提高仑伐替尼浓度(HuH7 从 3μM 至 30μM，PLC/PRF/5 从 20μM 至 60μM)，历时 6 个月构建耐药细胞系(HuH7 LR、PLC/PRF/5 LR);通过裸鼠皮下 / 原位移植及 3 代筛选，建立耐药动物模型(Hep1-6 LR)。

机制探究：采用 TMT 蛋白组学、磷酸化 RTK 阵列筛选差异分子;通过 Western blot、qPCR 验证 EGFR-STAT3-ABCB1 通路激活;免疫荧光、邻近连接实验(PLA)检测 EGFR 与 ABCB1 在脂质筏的共定位;胆固醇检测、MβCD(破坏脂质筏)验证脂质筏依赖机制。

功能验证：FITC - 仑伐替尼外排实验检测药物排泄能力;shRNA 沉默 / 过表达 EGFR、STAT3、ABCB1，评估对耐药表型的影响。

联合治疗验证：体外 CCK-8、克隆形成、凋亡实验检测仑伐替尼 + 厄洛替尼(EGFR 抑制剂)的协同效应;体内裸鼠移植瘤模型评估联合用药的抑瘤效果及安全性。

临床验证：收集 9 例仑伐替尼治疗的肝癌患者样本(3 例 PR、3 例 SD、3 例 PD)，通过 qPCR、免疫组化验证通路分子表达与耐药的关联。

实验结果

图1：仑伐替尼耐药细胞与动物模型建立

该图证实模型稳定性：耐药细胞(HuH7 LR、PLC/PRF/5 LR)的仑伐替尼 IC₅₀分别是敏感细胞的 16.76 倍和 2.64 倍，停药 1 个月后耐药表型仍维持(图 1A);体内模型中，耐药组肿瘤对仑伐替尼无响应，体积和重量与对照组无差异，而敏感组肿瘤明显缩小(图 1B-F)。

图2：EGFR-STAT3-ABCB1 通路在耐药模型中激活

该图明确核心通路：蛋白组学和 RTK 阵列显示，耐药细胞中 EGFR 磷酸化水平显著升高(图 2B);Western blot 证实 p-EGFR、p-STAT3、ABCB1 在耐药细胞中高表达(图 2C);过表达 EGFR 可上调 p-STAT3 和 ABCB1，沉默 EGFR 则显著抑制二者表达(图 2D-E);STAT3 抑制剂 Stattic 可下调 ABCB1，且 STAT3 Y705 磷酸化是 ABCB1 表达的关键(图 2F);免疫荧光和 PLA 证实 EGFR 与 ABCB1 在脂质筏共定位(图 2G-I)。

图3：EGFR 以脂质筏依赖方式激活 ABCB1

该图揭示调控机制：耐药细胞胆固醇含量显著升高，脂质筏标志物(CAV1、FLOT1)与 EGFR、ABCB1 的结合增强(图 3F-G、I);脂质筏提取实验显示，耐药细胞脂质筏中 EGFR 和 ABCB1 表达显著高于敏感细胞(图 3K);MβCD 破坏脂质筏后，ABCB1 膜定位和功能显著减弱(图 3L)，证实 EGFR 对 ABCB1 的激活依赖脂质筏结构。

图4：临床样本验证通路激活与耐药关联

该图临床转化价值：PD 患者(耐药)肿瘤组织中 EGFR、ABCB1 mRNA 及胆固醇合成关键酶表达显著高于 PR/SD 患者(敏感)(图 4B-C);免疫组化显示，耐药患者和 Hep1-6 LR 模型中，p-EGFR、EGFR、ABCB1、STAT3 表达均显著升高(图 4D)。

图5：ABCB1 介导仑伐替尼外排导致耐药

该图证实功能核心：耐药细胞的仑伐替尼外排速率显著快于敏感细胞，FITC - 仑伐替尼荧光强度在耐药细胞中快速衰减(图 5C-F);LC-MS 检测显示，耐药细胞上清中仑伐替尼浓度在 6 小时后持续高于敏感细胞(图 5A)，证实 ABCB1 通过增强药物外排介导耐药。

图6：仑伐替尼 + 厄洛替尼具有协同抑瘤效应

该图验证联合治疗效果：体外实验中，联合用药使 HuH7 LR 的仑伐替尼 IC₅₀从 53.29μM 降至 1.94μM(低于敏感细胞的 3.18μM)，组合指数(CI<1)证实协同效应(图 6E-F);克隆形成和凋亡实验显示，联合组细胞存活减少、凋亡增加(图 6G、 Supplementary Figure S5H-K);体内模型中，联合用药(仑伐替尼 3mg/kg + 厄洛替尼 10mg/kg)显著抑制耐药肿瘤生长，且无明显肝肾功能损伤和体重下降(图 6I-J)。

图7：厄洛替尼通过阻断 EGFR-STAT3-ABCB1 通路抑制药物外排

该图阐明联合机制：Western blot 显示，厄洛替尼可显著下调耐药细胞中 p-EGFR 和 ABCB1 表达，联合用药以 1/3 剂量即可达到单药全剂量的抑制效果(图 7A);免疫荧光证实，联合用药减少 EGFR 与 ABCB1 在脂质筏的共定位(图 7B-E);FITC - 仑伐替尼外排实验显示，厄洛替尼可显著延缓药物排泄，延长细胞内药物滞留时间(图 7F-G)。

研究结论

本研究首次证实：肝癌细胞通过激活 EGFR-STAT3-ABCB1 通路获得仑伐替尼耐药，其核心机制为 EGFR 在脂质筏依赖下激活 STAT3，进而上调 ABCB1 表达，增强药物外排;临床样本验证该通路激活与患者耐药直接相关。厄洛替尼可双重抑制 EGFR 磷酸化和 ABCB1 功能，与仑伐替尼联合使用时，通过阻断上述通路显著逆转耐药，且在体内外均表现出强效协同效应，安全性良好。该研究揭示了肝癌仑伐替尼耐药的关键机制，为临床耐药患者提供了可转化的联合治疗方案。