告别瞬时信号！稳定表达 FLuc 的肝癌细胞系，让体内成像更靠谱

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Hepa1-6-FLuc cell line with the stable expression of firefly luciferase retains its primary properties with promising bioluminescence imaging ability

中文标题：稳定表达萤火虫荧光素酶的 Hepa1-6-FLuc 细胞系保留其原始特性且具有良好的生物发光成像能力

发表期刊：《ONCOLOGY LETTERS》

影响因子：2.2

作者单位：

1. Stem Cell Biology and Therapy Laboratory, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders;

2. Department of Pediatric Surgery;

3. Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing, International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders, The Children's Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, P.R. China

作者信息：

Yasha Li¹⁻³, Mengnan Liu¹,², Jiejie Cui¹⁻³, Ke Yang¹,³, Li Zhao¹,³, Mengjia Gong¹,³, Yi Wang², Yun He², Tongchuan He¹⁻³ and Yang Bi¹⁻³*

研究背景

肝细胞癌(HCC)发病率、死亡率和复发率高，中国是高发地区，占全球病例的 45% 以上，亟需可靠的动物模型用于肿瘤机制研究和化疗药物评估。生物发光成像(BLI)技术具有高灵敏度、无创定量等优势，已广泛应用于肿瘤研究，但腺病毒介导的萤火虫荧光素酶(FLuc) transient 表达存在信号不稳定、易消失的问题。小鼠肝癌细胞系 Hepa1-6 因恶性程度高、免疫原性低，常用于构建肝癌模型。本研究通过逆转录病毒介导 FLuc 基因稳定表达，构建 Hepa1-6-FLuc 细胞系，验证其是否保留母本细胞特性，同时实现体内肿瘤的稳定追踪。

研究方法

Hepa1-6 细胞和 HEK-293 细胞用含 10% FBS 的 DMEM 培养基培养;将含 FLuc 基因和杀稻瘟素抗性基因的逆转录病毒载体与 pCLAmpho 载体共转染 293 细胞包装病毒，感染 Hepa1-6 细胞后，用 3μg/ml 杀稻瘟素筛选 14 天获得稳定细胞系 Hepa1-6-FLuc;通过 MTT 法、结晶紫染色、克隆形成实验检测细胞增殖活力，划痕实验和 Transwell 实验评估迁移侵袭能力;将 Hepa1-6、Hepa1-6-FLuc 及腺病毒感染的 Hepa1-6-AdFLuc 细胞分别皮下接种裸鼠(1×10⁶细胞 / 只)，通过 IVIS-200 系统检测不同时间点生物发光信号，14 天后处死小鼠，测量肿瘤大小并进行 H&E 染色;数据用 SPSS 18.0 分析，p<0.05 为显著。

实验结果

图1：Hepa1-6-FLuc 细胞系的构建

该图显示杀稻瘟素筛选 14 天后，母本 Hepa1-6 细胞全部死亡，而 Hepa1-6-FLuc 细胞存活率为 5%-7%;第 5 代 Hepa1-6-FLuc 细胞形态与母本细胞一致，均呈均一形态;荧光素酶活性检测显示，Hepa1-6-FLuc 细胞的相对发光单位显著高于母本细胞(p<0.05)，证实成功构建稳定表达 FLuc 且具有杀稻瘟素抗性的细胞系。

图2：Hepa1-6-FLuc 与母本细胞的增殖及克隆形成能力对比

该图通过 MTT 法和结晶紫染色证实，Hepa1-6-FLuc 细胞的生长曲线与母本 Hepa1-6 细胞一致，均呈典型 S 形，无显著增殖差异;克隆形成实验显示，两者克隆形成率分别为 26.59±2.67% 和 25.67±6.68%，差异无统计学意义(p>0.05)，表明稳定表达 FLuc 不影响细胞增殖和克隆形成能力。

图3：Hepa1-6-FLuc 与母本细胞的迁移及侵袭能力对比

该图通过划痕实验发现，Hepa1-6-FLuc 与母本细胞在不同时间点的伤口愈合速度相似;Transwell 迁移和侵袭实验显示，两组细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数无显著差异(p>0.05)，证实稳定表达 FLuc 不改变细胞的迁移和侵袭特性。

图4：Hepa1-6-FLuc 细胞的体内生物发光成像效果

该图显示裸鼠接种后 1 天，Hepa1-6-FLuc 与 Hepa1-6-AdFLuc 细胞的发光信号相似;随着肿瘤生长，Hepa1-6-FLuc 细胞的生物发光信号逐渐增强，而 Hepa1-6-AdFLuc 细胞的信号逐渐减弱，14 天后基本消失;母本 Hepa1-6 细胞无发光信号，证实稳定表达 FLuc 可实现体内肿瘤的持续追踪。

图5：三组细胞形成肿瘤的大小及病理形态

该图显示 14 天后，Hepa1-6、Hepa1-6-FLuc 及 Hepa1-6-AdFLuc 细胞形成的肿瘤大小无显著差异(p>0.05);H&E 染色显示，三组肿瘤细胞均呈多边形、形态不规则、核深染、胞质少，具有典型肝癌细胞特征，仅 Hepa1-6-AdFLuc 组肿瘤出现较多新生血管，血管腔内可见肿瘤细胞，表明腺病毒感染可能促进肿瘤血管生成，但稳定表达 FLuc 不改变肿瘤病理特性。

研究结论

本研究成功通过逆转录病毒介导，构建了稳定表达萤火虫荧光素酶(FLuc)的 Hepa1-6-FLuc 细胞系。该细胞系保留了母本 Hepa1-6 细胞的形态、增殖、迁移及侵袭等核心生物学特性，皮下接种裸鼠后可形成与母本细胞相似的肿瘤，且生物发光信号随肿瘤生长持续增强，相比腺病毒介导的瞬时表达(信号逐渐消失)更能准确反映体内肿瘤细胞的增殖和存活状态。Hepa1-6-FLuc 细胞系可替代母本细胞构建肝癌动物模型，为肝癌发病机制研究、肿瘤动态监测及抗癌药物筛选提供了高效、可靠的工具。