THP-1 细胞实锤：小白菊内酯不杀细胞也抗炎，关键是“沉默” iNOS 启动子

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Inhibition by Parthenolide of Phorbol Ester-Induced Transcriptional Activation of Inducible Nitric Oxide Synthase Gene in a Human Monocyte Cell Line THP-1

中文标题：小白菊内酯通过抑制转录激活阻断佛波酯诱导的人 THP-1 细胞 iNOS 基因表达

发表期刊：《Biochemical Pharmacology》

影响因子：5.6

作者单位：

1. Department of Oriental Medicine, Gifu University School of Medicine, Gifu 500-8705, Japan

2. Cancer Prevention Division, National Cancer Center Research Institute, Chuo-ku, Tokyo 104-0045, Japan

3. Second Department of Internal Medicine, Gifu University School of Medicine, Gifu 500-8705, Japan

作者信息：

Kazunori Fukuda*†, Yuko Hibiya‡, Michihiro Mutoh‡, Yasushi Ohno§, Kazuya Yamashita§, Seigou Akao*, Hisayoshi Fujiwara§

研究背景

诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在炎症细胞中过度激活会大量产生一氧化氮(NO)，NO 与超氧阴离子反应生成强氧化性的过氧亚硝酸盐(ONOO⁻)，进而导致组织损伤，是多种炎症疾病的关键致病因素。小白菊(Tanacetum parthenium)的主要活性成分小白菊内酯(parthenolide)已被证实可抑制环氧合酶和促炎细胞因子表达，但对 iNOS 基因转录的调控作用尚未明确;佛波酯(TPA)可通过激活 PKC-MAPK-NF-κB 通路特异性诱导 iNOS 基因表达。本研究构建人 iNOS 启动子驱动的荧光素酶报告基因系统，在 THP-1 细胞中探究小白菊内酯对 iNOS 转录的调控，揭示其抗炎分子靶点。

研究方法

核细胞系 THP-1 用含 5% 热灭活 FBS 的无酚红 RPMI-1640 培养基培养，TPA 和小白菊内酯用 DMSO 溶解后稀释至工作浓度;构建空载体 pB2-BSD(含 BSD 抗性基因和荧光素酶基因)与 iNOS 报告质粒 piNOS/B2-BSD(插入人 iNOS 启动子片段 - 1090 至 + 33)，转染 THP-1 细胞后用杀稻瘟素筛选稳定细胞系(THP-1/B2-BSD、THP-1/iNOS-B2-BSD);通过 WST-1 法检测细胞活力，荧光素酶活性检测 iNOS 启动子转录活性，同时用巯基化合物干预验证作用机制;数据以 “均值 ± 标准误” 表示，每组 4 复孔、重复≥3 次，用重复测量 ANOVA 分析，p<0.05 为显著。

实验结果

图1：报告基因质粒构建流程

该图展示两种核心质粒的组成与构建逻辑，均含荧光素酶基因(Luc，报告基因)、杀稻瘟素抗性基因(BSD，筛选标记)、氨苄抗性基因(Amp，质粒扩增标记)和多克隆位点(MCS);空载体 pB2-BSD 无特异性启动子，仅排除载体骨架干扰，报告质粒 piNOS/B2-BSD 将人 iNOS 启动子插入 MCS，使 Luc 表达受 iNOS 启动子调控，为后续检测提供特异性工具。

图2：TPA 对 iNOS 启动子活性的诱导作用

该图验证 iNOS 启动子的可诱导性：THP-1/B2-BSD 细胞(空载体)基础荧光素酶活性极低，TPA 处理后无显著变化;THP-1/iNOS-B2-BSD 细胞基础活性是空载体的 40 倍以上，TPA 以剂量依赖性诱导其活性升高(0.1ng/mL 即显著诱导，20-50ng/mL 达平台期)，证实 TPA 可特异性激活 iNOS 启动子转录，实验模型有效。

图3：小白菊内酯对 iNOS 启动子活性的剂量依赖性抑制

该图量化小白菊内酯的抑制效应：非 TPA 刺激下，其浓度 > 2.5μM 时剂量依赖性抑制 iNOS 启动子基础活性(IC₅₀≈10μM);TPA 诱导使活性升高 5 倍以上，小白菊内酯对该诱导活性抑制更强(IC₅₀≈2μM，5μM 即可降至未处理水平);浓度≤10μM 时无显著细胞毒性，证实抑制效应与毒性无关。

图4：巯基化合物对小白菊内酯抑制作用的逆转效应

该图探究作用机制：向 TPA + 小白菊内酯(10μM)处理组加入 L - 半胱氨酸、DTT 或 2 - 巯基乙醇，荧光素酶活性随巯基化合物浓度升高而恢复，提示小白菊内酯通过与靶蛋白巯基结合发挥作用，结合 PKC 抑制剂的协同效应，推测其靶向 PKC/NF-κB 通路中的巯基依赖型蛋白。

研究结论

本研究首次通过特异性报告基因系统证实：

小白菊内酯可剂量依赖性抑制人 THP-1 细胞 iNOS 基因启动子活性，对 TPA 诱导的转录激活抑制更强(IC₅₀=2μM)，且与细胞毒性无关;其作用依赖于与靶蛋白巯基结合，巯基化合物可完全逆转该效应，推测靶向 PKC/NF-κB 通路中的巯基蛋白(如 IκB 激酶)。该发现补充了小白菊内酯的抗炎机制 —— 除抑制环氧合酶和促炎细胞因子外，还通过阻断 iNOS 转录减少 NO 过度生成，为其临床抗炎应用提供实验依据。