荧光素酶报告病毒新突破：H1N1 靠这两种修饰，兼顾筛选与活体成像

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Modification of H1N1 Influenza Luciferase Reporter Viruses Using StopGo Translation and/or Mouse-Adapted Mutations

中文标题：H1N1 流感荧光素酶报告病毒的修饰：基于 StopGo 翻译与小鼠适应突变的优化

发表期刊：《Viruses》

影响因子：3.5

作者单位：

Department of Host-Microbe Interactions, St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis, TN 38105, USA

作者信息：

Po-Ling Chen, Guohua Yang, Chet Ojha, Balaji Banoth, Charles J. Russell

研究背景

甲型 H1N1 流感病毒每年引发全球数百万感染及 30 万 - 65 万死亡，荧光素酶报告病毒是研究病毒 - 宿主互作、高通量抗病毒筛选及活体感染监测的关键工具。此前基于 2009 年 H1N1 毒株(A/Tennessee/1-560/2009，TN09)构建的 rTN09-PA-Nluc 报告病毒，将 NanoLuc(Nluc)与 PA 蛋白(流感 RNA 聚合酶亚基)融合表达，却因融合蛋白设计在 MDCK 细胞和小鼠中显著衰减，需依赖小鼠适应突变恢复活性。本研究假设 “融合蛋白是衰减的核心原因”，通过两种策略优化病毒：①引入基于口蹄疫病毒(FMDV)2A 肽的 StopGo 翻译，使 PA 与 Nluc 从同一开放阅读框(ORF)分离表达;②引入小鼠适应突变(PB2-E158G、PA-D479N)，对比两种策略及组合在体外(细胞)和体内(小鼠)的效果，明确报告病毒优化的关键机制与适用场景。

研究方法

细胞与病毒基础准备：

细胞：MDCK(犬肾细胞)、Vero(非洲绿猴肾细胞)、LA-4(小鼠肺腺癌细胞)，分别用含 5% FBS 的 MEM、M199、F-12K 培养基培养;

病毒：构建 7 种病毒(表 1)，包括野生型(rTN09-WT)、融合型报告病毒(f_PA-Nluc)、StopGo 型报告病毒(sg_PA-Nluc)，及含小鼠适应突变(MA9：PB2-E158G;PA-D479N)的衍生病毒(f_MA9、sg_MA9、f_MA9_479、sg_MA9_479)。

病毒构建与拯救：

质粒：采用 8 质粒反向遗传系统，将 TN09 的 PA 基因与 Nluc 通过 FMDV 2A 肽(StopGo 关键元件)连接构建 sg_PA-Nluc 质粒，通过定点突变引入 PB2-E158G 和 PA-D479N;

拯救：Vero 细胞电穿孔转染 8 种质粒，MDCK 细胞扩增病毒，用 TCID₅₀、空斑实验、血凝(HA)实验测定滴度。

体外功能验证：

蛋白表达：Western blot 检测 PA、Nluc 及融合蛋白(PA-Nluc)，抗体分别为抗 H1N1 PA(C 端)、抗 Nluc、抗 2A 肽;

生长曲线：MDCK 细胞(MOI=0.001)、LA-4 细胞(MOI=3)中培养病毒，每日测滴度;

荧光素酶活性：MDCK 细胞感染后 0-6 小时，用 Nano-Glo 底物检测生物发光(RLU 值)。

体内功能验证：

小鼠模型：DBA/2J 雌性小鼠鼻内接种 750 PFU 病毒，监测 14 天生存率和体重(减重 > 25% 安乐死);

活体成像：眼眶后注射 Nluc 底物，IVIS CCD 相机捕获肺部生物发光;

病毒载量：取肺组织测 TCID₅₀量化复制。

中和实验：

血清处理：小鼠抗 TN09 血清经 RDE 酶解、56℃灭活后 2 倍稀释;

检测：血清与病毒(100 TCID₅₀)孵育后感染 MDCK 细胞，通过生物发光(24 小时)和 HA 实验(3 天)计算 50% 中和滴度(NT₅₀)。

统计分析：

用 GraphPad Prism 10，体外数据用双向 ANOVA(Dunnett 多重比较)，体内数据用双向 ANOVA(Šidák 多重比较)，p<0.05 为显著。

实验结果

图1：StopGo 翻译提升体外蛋白表达、复制与生物发光

图1 聚焦体外关键指标：① 蛋白表达：融合型病毒(f_PA-Nluc)仅表达 PA-Nluc 融合蛋白(~100 kDa)，PA 总表达量仅为 WT 的 13%(p<0.0001);StopGo 病毒(sg_PA-Nluc)同时表达 PA、Nluc 及 PA-Nluc，PA 总表达量与 WT 无差异，Nluc 活性较 f_PA-Nluc 提升 67 倍(p<0.0001);含 MA9 突变的病毒(f_MA9、sg_MA9)Nluc 活性进一步增强，但 PA-D479N 无额外增益。② 病毒复制：MDCK 细胞中，f_PA-Nluc 高度衰减(峰值滴度 1.1×10⁴ TCID₅₀/mL)，sg_PA-Nluc 峰值滴度达 1.9×10⁷ TCID₅₀/mL(较 f_PA-Nluc 高 1700 倍，接近 WT 的 4.4×10⁷ TCID₅₀/mL，p<0.05);LA-4 细胞(小鼠来源)中，无适应突变的病毒几乎无法复制，含 MA9 突变的病毒(如 sg_MA9)滴度接近 WT(~1000 TCID₅₀/mL)。③ 生物发光：MDCK 细胞感染 6 小时后，sg_PA-Nluc 的生物发光(~1×10⁷ RLU)是 f_PA-Nluc 的 67 倍(p<0.0001)，含 MA9 突变的病毒发光信号更强。

图2：StopGo 病毒加速中和实验，24 小时出结果

图2 对比传统与生物发光中和实验：野生型病毒(WT)的 NT₅₀为 1280(HA 和 TCID₅₀一致);sg_PA-Nluc 的生物发光 NT₅₀为 1547，与 HA 实验结果(1280)高度一致，且动态范围更广;f_PA-Nluc 因衰减导致 NT₅₀偏高(2560)。证实 sg_PA-Nluc 可将中和实验时间从 3 天缩短至 24 小时，适合高通量抗病毒筛选。

图3：小鼠适应突变是体内毒力恢复的核心，StopGo 无效

图3 评估小鼠体内活性：① 生存与体重：无适应突变的病毒(f_PA-Nluc、sg_PA-Nluc)无小鼠死亡，体重减轻 <10%;含 MA9 突变的病毒(f_MA9、sg_MA9)导致 100% 小鼠死亡，体重减轻> 25%(与 WT 一致)。② 肺病毒载量：sg_PA-Nluc 的肺滴度虽高于 f_PA-Nluc，但仍低于 WT;f_MA9 和 sg_MA9 的肺滴度与 WT 无差异，sg_MA9 在感染 1 天时滴度甚至高于 WT(p<0.05)。③ 活体成像：所有报告病毒均能产生肺部生物发光，但 f_PA-Nluc 与 sg_PA-Nluc 信号无显著差异;含 MA9 突变的病毒信号更稳定，与病毒载量正相关。

研究结论

本研究明确两种策略的核心价值与适用场景：

① StopGo 翻译的优势在体外：通过 FMDV 2A 肽实现 PA 与 Nluc 分离表达，显著提升 MDCK 细胞中 PA 和 Nluc 表达，恢复病毒复制(滴度较融合型高 1700 倍)，并将中和实验时间从 3 天缩短至 24 小时，适合高通量抗病毒筛选和体外机制研究，但无法恢复小鼠体内毒力。

② 小鼠适应突变的优势在体内：PB2-E158G(MA9 突变)通过增强流感 RNA 聚合酶活性，完全恢复病毒在 LA-4 细胞和小鼠中的毒力(100% 致死率、WT 级肺载量)，PA-D479N 无额外增益;含 MA9 的报告病毒(如 sg_MA9)可实现小鼠肺部高效活体成像。

③ 无显著协同效应：StopGo 与小鼠适应突变结合未进一步提升病毒活性，提示两种策略针对衰减的不同机制(融合蛋白 vs. 聚合酶活性)，需根据研究场景选择(体外选 StopGo，体内选小鼠适应突变)。该研究为流感报告病毒设计提供 “场景化优化框架”，为快速抗病毒筛选和体内感染监测提供实用工具。