原代脑细胞分离全攻略：从技术步骤到难题破解，为神经科学研究奠基

原代脑细胞的分离是研究中枢神经系统细胞行为、信号通路及疾病机制的关键基础。来自美国西部健康科学大学的团队(Yssel Mendoza-Mari、Anshu Aggarwal 等参与)在《Archives of Clinical and Biomedical Research》(2025, 9:286-296)发表综述，系统阐述了神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的分离与培养步骤，强调原代细胞保留天然功能和结构的优势(无需基因修饰，区别于永生化细胞系)。通过 MAP-2、GFAP、IBA-1 等标记蛋白可验证细胞身份及表型变化，并深入分析了分离过程中的技术难题(如细胞活力、纯度、批次差异)及解决方案，为神经科学研究提供了标准化的实验参考。

本研究旨在总结原代脑细胞(神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞)的分离方法、鉴定标准及技术挑战的应对策略。核心内容包括：从脑组织 dissection、机械 / 酶解分离到单细胞悬液制备的通用步骤;利用免疫磁珠(基于细胞表面标记如 CD11b、ACSA-2)和 Percoll 梯度离心等技术分离特定细胞类型;通过免疫荧光、流式细胞术等验证细胞纯度(神经元用 MAP-2，星形胶质细胞用 GFAP，小胶质细胞用 IBA-1);针对分离中的污染、活力低、批次差异等问题提出解决方案(如严格无菌操作、优化酶解条件、使用 ROCK 抑制剂)。该综述为标准化原代脑细胞分离提供了实用指南，助力神经疾病机制研究和药物筛选。

研究背景

神经系统疾病(如创伤性脑损伤、中风、神经退行性疾病)的发病机制复杂，依赖对脑细胞功能的精准解析。永生化细胞系虽易培养，但因基因修饰失去天然表型，难以模拟体内状态;而原代细胞保留组织来源的结构和功能特性，是更理想的研究模型。

然而，原代脑细胞分离面临多重挑战：脑组织 dissection 易污染，酶解过度会损伤细胞，不同细胞类型(神经元、胶质细胞)的分离纯度低，细胞活力受环境因素(pH、CO₂、底物涂层)影响大，且批次差异(组织来源的年龄、性别、物种)导致实验重复性差。此外，人类脑组织获取受伦理和实际条件限制，多依赖动物模型，结果外推存在局限。

实验结果

图 1：主要脑细胞类型及其功能

该图展示中枢神经系统的关键细胞类型：神经元通过电信号和化学信号传递信息;星形胶质细胞维持细胞外离子平衡、调控脑血流并支持血脑屏障;少突胶质细胞产生髓鞘包裹轴突;小胶质细胞作为主要免疫细胞，负责吞噬 debris 和神经保护;室管膜细胞参与脑脊液生成与稳态调控。图中明确各细胞的核心功能，为后续分离目标提供生物学基础。

图 2：原代脑细胞分离的通用流程

该图概述分离关键步骤：从目标脑区(如前额叶皮层、海马) dissection 组织，去除脑膜后，经机械破碎和酶解(如胰蛋白酶)获得单细胞悬液;过滤(70μm 筛网)去除团块，离心纯化后，通过免疫磁珠分选(基于 CD11b、ACSA-2 等标记)或 Percoll 梯度离心(35%-70% 密度层)分离特定细胞类型;最终通过流式细胞术或免疫染色验证纯度并接种培养。流程强调无菌操作和细胞活力保护，为标准化分离提供操作框架。

图 3：神经元的特异性标记物

该图列出神经元鉴定的核心标记：MAP-2(神经元特异性细胞骨架蛋白，指示表型)、TUBB3(参与神经元分化的微管组件)、DCX(迁移神经元的神经发生标记)、NeuN(成熟神经元的核蛋白)及神经丝蛋白(NEFL/NEFM/NEFH，细胞骨架关键成分)。这些标记可通过免疫荧光或 Western blot 验证神经元身份及发育阶段。

图 4：星形胶质细胞的特异性标记物

该图显示星形胶质细胞的特征标记：GFAP(胶质纤维酸性蛋白，同时标记部分少突胶质前体细胞)、S100B(钙结合蛋白)、谷氨酰胺合成酶(参与氮代谢的关键酶)。这些标记用于区分星形胶质细胞与其他胶质细胞，尤其 GFAP 是活性 / 静息状态表型分析的常用指标。

图 5：小胶质细胞的特异性标记物

该图总结小胶质细胞的鉴定标记：IBA-1(通用标记，广泛用于组织定位)、CD68(炎症状态高表达)、CD11b/CD45(表面标记，与其他免疫细胞共有)、TMEM119 和 P2Y12R(特异性最高的通用标记);并区分 M1(促炎，表达 CD16/CD32)和 M2(抗炎，表达 CD163/CD206)表型。标记物组合可精准识别小胶质细胞及其功能状态。

图 6：分离与培养中的问题及解决方案

该图列举关键挑战及应对：环境控制方面，pH/CO₂异常可通过监测培养箱参数(通常 5% CO₂)解决;污染风险需通过无菌操作(如高压灭菌、抗生素添加)降低;细胞贴壁差可通过胶原 / 聚赖氨酸涂层改善;神经元无法分裂的局限可通过原代培养保留完整表型克服。图中提供实用解决方案，提升实验稳定性。

研究结论

原代脑细胞(神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞)的分离与培养是解析脑功能和神经疾病机制的关键工具。通过 dissection、酶解 / 机械分离、特异性分选(免疫磁珠或 Percoll 梯度)及标记物验证(如 MAP-2、GFAP、IBA-1)，可获得高纯度细胞;严格控制环境条件(pH、CO₂、底物涂层)并解决污染、活力低等问题，能显著提升实验可靠性。尽管存在批次差异和伦理限制，原代细胞仍是神经科学研究中模拟体内状态的最优选择，其标准化分离流程为基础研究和临床转化提供重要支撑。