cGAS激活与细胞内酸化协同促进STING聚集和肿瘤模型中的焦亡

基本信息

英文标题：cGAS activation converges with intracellular acidification to promote STING aggregation and pyroptosis in tumor models

中文标题：cGAS激活与细胞内酸化协同促进STING聚集和肿瘤模型中的焦亡

发表期刊：《The Journal of Clinical Investigation》

影响因子：13.7

作者单位：厦门大学第一附属医院、厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室、厦门大学药学院等

作者信息：Li Xiao, Yuan-li Ai, Xiang-yu Mi, Han Liang, Xiang Zhi, Xianming Deng, Fu-nan Li, Qiao Wu, Hang-zi Chen 等

研究背景

cGAS/STING通路在抗肿瘤免疫中具有重要作用，但其在肿瘤细胞死亡中的直接作用尚不明确。本研究旨在探索cGAS/STING通路是否以及如何直接诱导肿瘤细胞焦亡。

研究创新点

首次发现小分子化合物DHN通过非经典cGAS/STING通路诱导黑色素瘤细胞焦亡;

揭示DHN通过靶向线粒体蛋白CypD促进mtDNA释放，激活cGAS并生成cGAMP;

发现DHN诱导的细胞内酸化激活PERK，促进STING磷酸化与聚合;

阐明STING在ER中形成聚集体，作为平台招募FADD和caspase-8，诱导GSDME介导的焦亡;

证明cGAS激活与细胞内酸化是诱导该焦亡通路的两个必要条件。

研究方法

细胞模型

使用A375黑色素瘤细胞、B16小鼠黑色素瘤细胞、Hepa1-6小鼠肝癌细胞等;

通过LDH释放、Western blot、免疫荧光、电镜等方法评估焦亡特征。

分子机制研究

使用DHN探针、点击化学、SPR、FL-DSF、CETSA等技术验证DHN与CypD的直接结合;

通过Phos-tag凝胶、聚合分析、免疫共沉淀等研究STING磷酸化与聚合;

利用TurboID邻近标记技术验证STING与caspase-8/GSDME的相互作用。

动物模型

使用裸鼠和C57BL/6小鼠建立A375、B16、Hepa1-6移植瘤模型;

腹腔注射DHN，评估肿瘤生长、免疫细胞活化及毒性。

实验结果

图1：DHN通过caspase-8介导的GSDME裂解诱导细胞凋亡。除非另有说明，黑色素瘤A375细胞经DHN(15μM)处理20小时后，检测其凋亡特征(包括典型形态、GSDME裂解及LDH释放)。

(A) DHN化合物库筛选及其化学结构。

(B) 不同时间点DHN诱导的细胞凋亡，红色箭头标示具有典型凋亡形态的细胞。通过Western blot检测GSDME裂解，通过LDH释放评估细胞死亡。

(C–F) 分别敲低GSDME(C)或caspase-8(F)的细胞，或与Z-VAD(D，20μM)或Z-IETD(E，10μM)共处理，随后检测凋亡。

(G) 将gsdmewt、GSDMED229A、GSDMED251A、GSDMED256A、GSDMED267A、GSDMED270A或GSDMED279A分别转染至GSDME敲低细胞，检测GSDME裂解水平。

(H) 将gsdmewt或GSDMED270A分别转染至GSDME敲低细胞，检测凋亡。微管蛋白用于确定蛋白加载量。数据以三次独立实验的平均值±标准误表示。统计分析采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验(B)，双因素方差分析结合Tukey多重比较检验(C–F和H)。图中标注P值。比例尺：100μm。所有Western blot实验至少重复两次，图中仅展示其中一次结果。IB：免疫印迹;LE：长曝光;SE：短曝光。

图2：DHN通过靶向线粒体蛋白CypD促进mPTP通道开放。黑色素瘤A375细胞经DHN(15μM)处理20小时以评估焦亡特征(包括典型形态、caspase8/GSDME裂解及LDH释放)，除非另有说明。

(A) DHN探针(DHN-P，左)的化学结构及DHN-P点击化学合成流程(右)。

(B) 细胞经DHN-P(150μM)处理2小时后，偶氮二叠氮荧光素与DHN-P偶联，显示DHN-P定位情况(Tom20，线粒体标记;CALR，内质网标记;GM130，高尔基体标记;LAMP2，溶酶体标记)。比例尺：20μm。

(C和D) 细胞分别在CsA(C，5μM)存在下或CypD敲低细胞中经DHN处理后检测焦亡。比例尺：100μm。

(E) 细胞经DHN-P(150μM)处理2小时后，加入叠氮生物素与DHN-P偶联，通过链霉亲和素磁珠检测靶向CypD的DHN-P。

(F) 通过表面等离子体共振测定DHN与CypD的结合亲和力。

(G) 细胞热移位实验。从细胞中免疫沉淀CypDWT或CypDR97A/Q105A蛋白，经DHN处理后进行15分钟差温孵育，所得裂解液经Western blot分析。

(H) 将CypDWT或CypDR97A/Q105A分别转染至CypD敲低细胞后检测焦亡。比例尺：100μm。(I)在细胞中敲低CypD基因，或用5μM环孢素A(CsA)共处理12小时后，检测线粒体膜电位(mPTP)的开放情况。通过微管蛋白定量确定蛋白加载量，共聚焦显微镜下使用核仁蛋白(DAPI)标记细胞核。数据以三次独立实验的平均值±标准误表示，统计分析采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验(C、D、G、H、I组)。图中标注了P值。所有蛋白质印迹实验均重复至少两次，此处仅展示其中一次结果。

图3：DHN诱导的线粒体DNA释放激活胞质cGAS。黑色素瘤A375细胞经DHN(15μM)处理12小时以显示cGAS斑点并检测线粒体DNA释放;经20小时处理以评估焦亡特征(包括典型形态、caspase8/GSDME裂解及LDH释放)，除非另有说明。

(A) 细胞与CsA(上，5μM)共处理，随后敲低CypD(中)或ANT1(下)后检测线粒体DNA释放。

(B和C) 细胞与CsA(B，5μM)共处理，随后敲低CypD或ANT1(C)，用抗cGAS抗体染色。通过共聚焦显微镜观察cGAS斑点。比例尺：20μm。统计具有cGAS斑点的细胞百分比(右，均值±标准误，n=3次重复)。单次实验中对100个细胞进行三次定量计数，三次统计测量的平均值记录为1次重复。

(D–F) 细胞与G140(E，30μM)共处理，敲除cGAS(D)或敲低sting(F)，随后检测焦亡。比例尺：100μm。使用微管蛋白确定上样蛋白量。数据以3次独立实验的均值±标准误表示。统计分析采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验(A–F)。标注P值。所有Western blot实验至少重复两次，此处仅展示其中一次结果。

图4：DHN通过诱导刺突蛋白聚集体形成来募集caspase-8和GSDME。为观察内质网中的刺突蛋白斑点并检测Triton X-100不溶性(TI)组分中的多种蛋白，将黑色素瘤A375细胞用DHN(15μM)处理12小时(除非特别说明)。

(A) 敲除cGAS的细胞或与G140(30μM)共处理的细胞经刺突蛋白抗体染色。共聚焦显微镜下可见刺突蛋白斑点(左图)，比例尺：20μm。细胞中刺突蛋白斑点的百分比经定量分析(右图，均值±标准误，n=3次重复)。

(B) 活细胞经DHN处理后可见刺突蛋白斑点与内质网共定位。比例尺：10μm。

(C和D) 电子显微镜观察刺突蛋白相关内质网结构。A375细胞(C)或表达刺突蛋白/APEX的A375细胞(D)经DHN处理12小时后观察内质网形态及刺突蛋白定位。比例尺：1μm和5μm。

(E) 刺突蛋白相关细胞器定位。转染刺突蛋白-HA的细胞经免疫沉淀后，通过不同抗体标记(CALR：内质网标记;GM130：高尔基体标记;Tom20：线粒体标记;LDHA：胞质标记)。

(F) 经DHN处理的细胞显示刺突蛋白与GSDME或caspase-8的共定位斑点。比例尺：5μm和10μm。

(G) CypD敲低(左)、刺突蛋白敲低(右)或cGAS敲除(中)细胞经DHN处理。图中显示了刺蛋白、切割后的CASP8和GSDME在TI中的定位。

(H) 将细胞转染GFP-V5-turboID或刺蛋白-V5-turboID后，用生物素(100μM)标记10分钟;随后分离生物素标记的蛋白质，并用对应抗体进行检测。数据以三次独立实验的平均值±标准误表示。统计分析采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验(A)，图中标注了P值。所有Western blot实验均重复至少两次，此处仅展示其中一次结果。

图5：DHN引起的内质网酸性环境促进刺状聚集体的形成。黑色素瘤A375细胞经DHN(15μM)处理12小时以显示内质网中的刺状点，并检测TI中刺状聚合物及各种蛋白质的位置，或经20小时处理以评估焦亡特征(除非特别说明)。

(A) 在细胞中敲低CypD(左图A)，或与G140(右图A，30μM)共处理后，指示刺状聚合物。

(B和C) 将stingwt、STINGC206S和STINGC148S分别转染至sting敲低细胞中，随后指示刺状聚合物(B)。通过共聚焦显微镜观察刺状点(C，左);标尺：20μm。细胞中刺状点的百分比被量化(C，右)。

(D) 细胞经不同浓度的DHN处理(左)，或与铵根Cl共处理(右，5 mM)，随后测量胞质pH值。

(E–I) 细胞与铵根Cl(5 mM)共处理后，检测刺状聚合物(E);使用电子显微镜观察内质网形态(F)，标尺：1μm和2μm(放大);通过共聚焦显微镜观察刺状点和内质网点(G)，标尺：20μm;TI中刺状、裂解-CASP8和GSDME的定位(H);以及焦亡，标尺：100μm(I)。使用微管蛋白确定加载蛋白的量。数据以3次独立实验的平均值±标准误表示。统计分析采用单因素方差分析(D，左)和双因素方差分析(C、D，右;I)配合Tukey多重比较检验。图中标注了P值。所有Western blot实验均重复至少两次，此处仅展示其中一次结果。

图6：cGAS激活与细胞内酸化共同作用诱导焦亡。黑色素瘤A375细胞经不同刺激物处理20小时以评估焦亡特征(包括典型形态、caspase8/GSDME裂解及LDH释放)，除非另有说明。

(A) 细胞与乳酸(20 mM)和2,3′-GAMP(10μg/mL)或diABZI(10μM)共处理后检测焦亡。

(B )细胞在乳酸(20 mM)或盐酸(20 mM)存在下感染HSV1(10 MOI)后检测焦亡。微管蛋白用于确定蛋白加载量。数据以3次独立实验的平均值±标准误表示。统计分析采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验。比例尺：100μm(A和B)。P值已标注。所有Western blot实验至少重复两次，此处仅展示其中一次结果。

图7：DHN诱导的PERK介导的sting磷酸化促进了sting的聚合。黑色素瘤A375细胞经DHN(15μM)处理12小时以检测sting磷酸化、内质网中的sting斑点、sting聚合体以及TI中各种蛋白质的位置;经20小时处理以评估焦亡特征，除非另有说明。

(A和B) 对照组(A，上)或PERK敲低的A375细胞(B，下)在存在铵根Cl(A，下，5 mM)或GSK2656157(B，上，10μM)的情况下用DHN处理。细胞裂解物与小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)孵育(A，中)。使用Phos-tag检测分析sting磷酸化。

(C) 细胞裂解物与CIAP孵育(上)。细胞与GSK2656157共处理(中，10μM)，并将PERKWT或PERKT982A分别转染至PERK敲低细胞中(下)。

(D) 细胞与GSK2656157(10μM)共处理;确定sting与PERK之间的相互作用。

(E) 细胞与铵根Cl(上，5 mM)和DHN共处理，或用乳酸(中和下，20 mM)处理，随后检测PERK和eIF2α的磷酸化。

(F–H) 细胞与GSK2656157(10μM)共处理或进行PERK敲低，随后检测sting聚合(F);sting斑点(G)，比例尺：20μm;以及焦亡，比例尺：100μm(H)。使用微管蛋白确定上样蛋白的量。数据以3次独立实验的平均值±标准误表示。统计分析采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验(G和H)，并标注P值。所有Western blot实验均重复至少两次，图中仅展示其中一次结果。

图8：PERK对刺突蛋白Ser345和Ser358位点的磷酸化作用是DHN诱导的细胞凋亡的关键。黑色素瘤A375细胞经DHN(15μM)处理12小时以检测刺突蛋白磷酸化及内质网中的刺突蛋白斑点;处理20小时以评估细胞凋亡特征(除非另有说明)。

(A) 将野生型刺突蛋白(stingwt)和STINGS345A/S358A突变体转染至刺突蛋白敲低细胞后，检测刺突蛋白磷酸化情况(上图)。将野生型刺突蛋白和STINGS345A/S358A突变体与PERK蛋白体外共孵育(下图)。

(B–D) 将野生型刺突蛋白和STINGS345A/S358A突变体转染至刺突蛋白敲低细胞后，检测刺突蛋白聚合情况(B);刺突蛋白斑点(C)，比例尺：20μm;细胞凋亡，比例尺：100μm(D)。使用微管蛋白定量确定蛋白加载量。数据以三次独立实验的平均值±标准误表示。统计分析采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验(C和D)。图中标注了P值。所有蛋白质印迹实验均重复至少两次，此处仅展示其中一次结果。

图9：DHN通过诱导小鼠细胞凋亡抑制肿瘤生长。将A375细胞(2×10⁶)皮下注射至裸鼠背部侧腹。4天后，每隔一天腹腔注射DHN，持续两周。在指定时间点记录肿瘤体积和重量。

(A-D) 将A375细胞注射至BALB/c-nu小鼠体内形成皮下异种移植瘤(A，n=6，比例尺：1厘米)。显示Ki67表达情况(B;n=9个独立肿瘤组织视野，比例尺：100μm)。收集肿瘤组织检测刺突蛋白(C)。白色箭头指示刺突点(D左，比例尺：20μm)，并量化具有刺突点的细胞比例(D右;n=9个独立肿瘤组织视野)。

(E-H) 敲低CypD的A375细胞(E和F)。比例尺：1厘米(E)。将刺突蛋白或刺突蛋白的单体、二聚体及寡聚体(G和H)注射至BALB/c-nu小鼠体内形成皮下异种移植瘤(n=8)。收集肿瘤组织检测刺突蛋白的单体、二聚体及寡聚体。比例尺：1厘米(G)。使用微管蛋白测定蛋白加载量。统计分析采用非配对双尾学生t检验(A、B、D)和Tukey多重比较检验的双向方差分析(E、G)。P值已标注。

图10：DHN在小鼠肿瘤模型中诱导抗肿瘤免疫应答。将A375细胞(2×10⁶)皮下注射至裸鼠背部侧腹。4天后，每隔一天腹腔注射DHN，持续两周。在指定时间点记录肿瘤体积和重量。

(A–C) 将表达stingwt、STINGC206S或STINGS345A/358A的A375敲低细胞注射至BALB/c-nu小鼠体内形成皮下异种移植瘤(I组，n=7)。收集肿瘤组织检测：(A)肿瘤组织中sting蛋白的表达水平(比例尺：1厘米);(B)sting蛋白的单体、二聚体及寡聚体形态;(C)sting蛋白磷酸化状态。

(D) 将B16细胞(上组，n=10)或Hepa1-6细胞(下组，n=8)注射至C57BL/6小鼠体内形成异种移植瘤，随后腹腔注射DHN。比例尺：1厘米。

(E) 在给予DHN(10 mg/kg)24小时后收集B16细胞来源的异种移植瘤，通过流式细胞术分析肿瘤微环境中免疫细胞的比例及活化状态(n=5)。使用微管蛋白作为蛋白加载量的参照物。统计分析采用非配对双尾t检验(D、E)和Tukey多重比较检验的双向方差分析(A)。图中标注了P值。

研究结论

DHN通过结合CypD促进mPTP开放，导致mtDNA释放至胞质，激活cGAS;DHN诱导的细胞内酸化激活PERK，促进STING在Ser345/Ser358位点磷酸化;磷酸化STING在ER中形成聚集体，招募FADD和caspase-8，诱导GSDME切割;cGAMP与STING结合是PERK介导STING磷酸化的前提;在免疫健全小鼠中，DHN诱导焦亡并增强CD8+ T细胞和NK细胞的活化;DHN在体内表现出良好的药代动力学和安全性。

研究结论：

本研究揭示了一条新型非经典cGAS/STING通路，通过协同cGAS激活与细胞内酸化，诱导STING在ER中形成聚集体，进而激活caspase-8/GSDME介导的焦亡。该机制不仅为肿瘤治疗提供了新靶点，也为理解cGAS/STING通路的多样性提供了新视角。