三氟胸苷/替吡嘧啶在结直肠癌3D类器官中诱导铁死亡

结直肠癌(CRC)是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，约占所有癌症病例的10%。约25%的原发性结直肠癌患者最终发展为转移性疾病，多线化疗失败后，患者生存率不足20%，被称为难治性结直肠癌。目前，一线药物或酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)常用于治疗难治性结直肠癌，但超过80%的晚期患者缺乏可用靶点，无法接受精准治疗。此外，重复使用氟尿嘧啶类药物存在固有和获得性耐药性问题，且多种化疗药物和靶向疗法的联合使用导致不良反应发生率升高。因此，开发新的治疗策略迫在眉睫。

2025年4月5日，发表在Cell Death & Disease上题为Trifluridine/tipiracil induces ferroptosis by targeting p53 via the p53-SLC7A11 axis in colorectal cancer 3D organoids的研究聚焦于三氟胸苷/替吡嘧啶(FTD/TPI，TAS102)，这是一种由三氟胸苷(FTD)和替吡嘧啶(TPI)按1:0.5摩尔比组成的口服抗肿瘤药物，已被批准用于晚期转移性结直肠癌患者。FTD/TPI通过胸苷激酶(TK)激活，形成三氟胸苷单磷酸盐(F3dTMP)，抑制胸苷酸合成酶(TS)，进而阻碍DNA合成。与5-氟尿嘧啶(5-FU)不同，FTD能大量掺入DNA，其抗肿瘤机制不仅限于诱导DNA链断裂。然而，FTD/TPI在结直肠癌中的具体作用机制尚未完全明确，尤其是其是否能够诱导铁死亡这一新型细胞死亡方式及其分子机制，仍需深入研究。

图示描述

1，FTD/TPI抑制结直肠癌细胞的活力和增殖：研究发现FTD/TPI以时间-剂量梯度方式降低四种结直肠癌细胞系(RKO、DLD1、HCT116和HT29)的活力。RKO、DLD1和HCT116在24-48小时内对FTD/TPI表现出较高敏感性，而HT29细胞在早期表现出相对较低的敏感性，需要72小时处理才能显著抑制细胞活力。药物处理后的克隆形成实验也表明FTD/TPI不同程度地抑制了结直肠癌细胞系的集落生长。转录组学和蛋白质组学测序结果显示，FTD/TPI处理导致RKO细胞中相关基因和蛋白质发生显著变化，特别是铁死亡调控通路相关分子。其中，转录因子p53被上调，而SLC7A11基因在FTD/TPI处理后显著下调，表明FTD/TPI可能通过p53-SLC7A11轴诱导铁死亡。

2，FTD/TPI通过多种细胞死亡途径诱导结直肠癌细胞死亡，尤其是铁死亡：为确认FTD/TPI对细胞死亡的主要影响，研究者将FTD/TPI与铁死亡抑制剂(ferrostatin-1)、坏死抑制剂(necrosulfonamide)、自噬抑制剂(bafilomycin A1)和凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)联合使用。结果表明，铁死亡抑制剂ferrostatin-1显著挽救了FTD/TPI诱导的细胞死亡，而坏死抑制剂的挽救效果较弱。当FTD/TPI与铁死亡激活剂erastin联合使用时，四种结直肠癌细胞系的活力均显著受到抑制。功能实验表明，FTD/TPI处理导致细胞内铁离子沉积、活性氧(ROS)和脂质过氧化增加，以及谷胱甘肽(GSH)减少。透射电子显微镜观察显示，处理48小时后的RKO和HCT116细胞线粒体发生不同程度的收缩，线粒体体积显著减小，同时膜密度增加，膜内高电子密度，嵴扩张，这些都是铁死亡的典型表现。

3，FTD/TPI通过p53-SLC7A11轴诱导结直肠癌铁死亡：转录组测序结果表明SLC7A11参与FTD/TPI处理过程。进一步研究发现，FTD/TPI抑制了四种结直肠癌细胞系中SLC7A11的mRNA和蛋白表达。使用铁死亡拮抗剂ferrostatin-1进行FTD/TPI处理时，有效逆转了FTD/TPI诱导的SLC7A11蛋白表达抑制，特别是在RKO和DLD1细胞系中。在四种结直肠癌细胞系中，FTD/TPI处理48小时后筛选铁死亡相关转录因子，结果显示内源性p53的mRNA和蛋白表达显著增加，以剂量和时间依赖方式抑制了SLC7A11表达。为研究FTD/TPI是否依赖转录因子p53调节下游靶点SLC7A11表达，研究者使用CRISPR/Cas9技术在DLD1细胞中敲除TP53基因，发现在野生型细胞中FTD/TPI梯度降低了SLC7A11蛋白表达，而在TP53敲除细胞中SLC7A11蛋白表达水平有一定恢复，活性氧和脂质过氧化累积水平减弱，证明FTD/TPI通过p53-SLC7A11轴诱导结直肠癌铁死亡。

4，FTD/TPI直接结合p53并通过促进MDM2泛素化和降解增强p53蛋白稳定性：为确定FTD/TPI如何影响p53蛋白激活铁死亡，研究者使用环己酰亚胺(CHX)抑制蛋白质翻译，发现FTD/TPI延长了p53蛋白的半衰期。与蛋白酶体抑制剂MG132联合处理增强了FTD/TPI诱导的p53蛋白积累，表明p53水平增加可能由于降解减少。MDM2是一种E3泛素连接酶，负调节p53，研究发现FTD/TPI处理降低了四种结直肠癌细胞系中MDM2的表达，且具有时间和剂量依赖性。体外泛素化实验表明，FTD/TPI显著增加了内源性和外源性MDM2的泛素化水平。细胞热稳定性实验(CETSA)和分子对接分析表明，FTD/TPI能够稳定结合p53蛋白，结合能高达-6.08 kcal/mol，预测的氨基酸结合位点包括Ser99、Ile254、Ile255、Met160、Leu264和Glu258，这些氨基酸位点在p53的结构和功能中发挥重要作用。

5，磺胺嘧啶(SAS)增强FTD/TPI对结直肠癌细胞的抑制作用：前期结果表明FTD/TPI与铁死亡激活剂联合使用能够促进结直肠癌细胞死亡。为进一步提高FTD/TPI在临床治疗中的效果，研究者选择了三种被建议作为铁死亡激活剂的临床药物与FTD/TPI联合处理——磺胺嘧啶(SAS)、蒿醚(ART)和双氢青蒿素(DHC)。MTT实验表明，SAS而非ART或DHC与FTD/TPI联合处理导致RKO和HT29细胞死亡显著增加，特别是SAS使HT29、HCT116和DLD1细胞对FTD/TPI的敏感性增强。机制研究发现，SAS进一步促进了FTD/TPI与联合使用时对SLC7A11和GPX4的抑制，增强了ROS和脂质过氧化水平的累积，表明SAS协同增强了FTD/TPI在结直肠癌细胞中的杀伤作用，可能是通过靶向SLC7A11实现的。

6，FTD/TPI抑制结直肠癌类器官的活力和增殖：为确定FTD/TPI是否通过诱导铁死亡抑制结直肠癌生长，研究者用FTD/TPI处理来自12名结直肠癌患者的肿瘤类器官。评估3D类器官的活力显示，类器官在7或14天的处理后以剂量依赖方式被FTD/TPI抑制，这与FTD/TPI在不同患者中的临床反应一致。免疫组化染色显示，随着FTD/TPI浓度增加，类器官中Ki67阳性细胞比例降低，表明细胞增殖受到抑制。在对FTD/TPI敏感的一个类器官中检测ROS和脂质过氧化，发现类器官细胞簇显示出显著的ROS和脂质过氧化荧光累积。FTD/TPI与erastin联合用药进一步破坏了类器官细胞簇形态，而ferrostatin-1则挽救了这种效应。Western blot和免疫组化染色显示，FTD/TPI增加了类器官细胞中p53蛋白水平，但降低了SLC7A11，表明铁死亡可能通过p53-SLC7A11轴参与FTD/TPI介导的结直肠癌类器官细胞死亡。同样，SAS联合FTD/TPI显著降低了9个患者类器官的活力，与细胞系实验结果一致。

7，FTD/TPI和SAS联合治疗在PDX模型中的抑制作用：为进一步验证FTD/TPI联合SAS在体内的疗效，研究者收集了两名患者手术后的新鲜结直肠癌组织建立PDX模型。结果显示，联合组的肿瘤生长速度明显慢于对照组和单药组，肿瘤重量和体积显著降低。联合FTD/TPI和SAS治疗不影响小鼠体重和心、肝、肾、肺组织学，表明联合治疗耐受性良好。组织化学染色显示，FTD/TPI单独给药抑制肿瘤细胞增殖并增加p53蛋白表达，而FTD/TPI和SAS联合治疗导致腺体萎缩和收缩，KI67和SLC7A11表达降低，表明SAS可能通过靶向SLC7A11增强FTD/TPI对结直肠癌生长的抑制作用。

全文总结

本研究揭示了FTD/TPI通过p53-SLC7A11轴诱导铁死亡，并且SAS增强了FTD/TPI的敏感性和治疗效果。这些发现表明FTD/TPI和SAS的协同作用可能代表结直肠癌患者的一种新治疗策略，尤其是对于那些已经发展为转移性疾病且对常规治疗产生耐药的患者。该研究拓展了FTD/TPI的作用机制，为临床上联合使用FTD/TPI与铁死亡激活剂提供了理论基础，有望改善晚期结直肠癌患者的预后。此外，该研究也为发展以铁死亡为基础的结直肠癌治疗策略提供了新思路，特别是针对那些没有可用靶点的患者群体。通过探索FTD/TPI的铁死亡治疗机制，该研究扩展了抗癌药理学的范围，为未来开发更有效的结直肠癌治疗方法奠定了基础。