免疫抑制对体外和体内人胚胎干细胞衍生视网膜类器官的影响

视网膜疾病是全球主要致盲原因之一，其中遗传性视网膜疾病在全球患病率为1/3450。特别是视网膜变性疾病如视网膜色素变性(RP)在美国的患病率为1/4000，全球患病率为1/5000，这类疾病通常早期发病，快速进展至视力丧失，且目前缺乏有效的预防措施和治疗方法。为此，科学家们一直在探索干细胞衍生的光感受器细胞作为细胞替代治疗的可能性，以补充RP患者因疾病而减少的光感受器数量和功能。多个研究团队已经开发了将人胚胎干细胞(hESCs)分化为三维视网膜类器官(ROs)的方案。这些类器官发展出视网膜的三种主要神经元类型和层次结构：光感受器细胞、中间神经元(双极细胞、无长突细胞)和视网膜神经节细胞。光感受器(视杆和视锥细胞)富集在球形三维结构中，构成类器官外层的层状区域。之前的研究表明，将光感受器富集的视网膜类器官片段移植到免疫缺陷型视网膜变性动物模型中，可以改善视功能。然而，为了评估其临床应用潜力，需要在免疫功能完整的视网膜变性疾病模型中进行评估，并采用有效的免疫抑制方案。

2025年4月5日，发表在Stem Cell Research & Therapy上题为Effect of immunosuppression on hESC-derived retina organoids in vitro and in vivo的研究使用的视网膜变性大鼠模型表达了在关键端氨基酸(丝氨酸残基334)上有突变的视紫红质，导致其组装提前截断。这种基因突变导致视杆细胞中视紫红质功能丧失，随后通过未折叠蛋白质反应机制发生凋亡。大量视杆细胞死亡导致暗视觉光转导功能相应减弱，随后视锥光感受器也受到功能损伤并死亡。这种情况下，视网膜发生系列变化，包括视网膜厚度减少和结构完整性丧失。

图示描述

1，视网膜类器官的特性和免疫原性评估：研究团队首先对用于移植的GMP兼容视网膜类器官进行了表征。这些类器官在分化第55天左右具有约90%的存活率，不表达干细胞标记物OCT4，约80%的细胞表达OTX2(通过流式细胞术检测)，且几乎所有类器官细胞表达RAX标记物。通过混合淋巴细胞反应(MLR)实验，研究者评估了视网膜类器官对致敏人免疫细胞的免疫原性。结果表明，与对照组相比，视网膜类器官诱导的T细胞增殖显著降低，MHC-II表达也明显减少，这表明视网膜类器官不太可能引起强烈的免疫反应。

2，免疫抑制药物对视网膜类器官体外发育的影响：研究者测试了霉酚酸(MPA，MMF的水解产物)和他克莫司(TAC)对视网膜类器官发育的影响。通过荧光寿命成像显微镜(FLIM)技术，评估了两批处于不同分化阶段的类器官(起始天数：68天和87天)在药物处理1周和4周后的代谢状态。结果显示，在相同批次和成像时间点下，药物处理组与对照组在自由与结合态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)比率方面没有显著差异，表明免疫抑制药物对视网膜类器官的发育没有明显影响。qPCR结果也证实，TAC和MPA处理的样本与对照组显示相似的基因表达水平，只有联合处理组在CRX和NRL基因表达方面出现轻微下调。

3，确定免疫抑制药物的有效治疗剂量范围：研究团队首先对非移植视网膜变性大鼠进行了剂量递增试验，确定了他克莫司和霉酚酸酯(MMF)的最低有效治疗阈值。结果显示，90天释放20mg他克莫司植入剂(相当于0.74-3.17 mg/kg/天)在治疗过程中的第25-55天达到0.8-4.6 ng/ml的血液峰值浓度。通过流式细胞术免疫表型分析，评估了他克莫司对T细胞和B细胞群体的抑制效果。结果表明，T细胞抑制的程度与他克莫司的血液峰值浓度呈正相关(相关系数0.89)。然而，免疫抑制(特别是他克莫司)对氯胺酮麻醉的反应有负面影响，39/92只免疫抑制大鼠在氯胺酮/赛拉嗪注射后因心脏骤停而过早死亡。

4，体内移植后视网膜类器官的长期存活与形态学评估：通过光学相干断层扫描(OCT)技术，研究者对移植后的视网膜变性大鼠进行了体内成像，评估移植物放置情况和周围眼组织的任何损伤。初始成像在移植后2周进行，随后每1-2个月进行一次后续扫描，以监测移植物体积和位置。研究发现，成功免疫抑制的免疫功能完整受体(n=8)和免疫缺陷受体(n=8)中的视网膜类器官移植物保持了一致的移植区域和局部解剖位置。长期存活(2.5-6个月)的移植物中，50%(4/8)的裸鼠移植组保留了>90%的移植区域，其中75%(3/4)在研究终点时移植区域有所增加。43%(4/8)长期存活的免疫抑制移植组保留了>90%的移植区域，其中50%(2/4)在研究终点时移植区域增加。

5，免疫抑制对适应性和先天性免疫反应的影响：研究发现，20mg他克莫司和300mg/kg MMF的给药方案导致免疫抑制移植大鼠呈现与免疫缺陷移植受体相似的免疫组织学特征。在两组中，移植物均显示出无T细胞、NK细胞或外周巨噬细胞浸润的特点。移植物耐受组中的小胶质细胞分布和活化状态与免疫缺陷、移植物耐受对照组相似。相比之下，未接受免疫抑制的免疫功能完整移植接受者或接受剂量不足的免疫抑制治疗者(低于20mg他克莫司单药治疗、MMF单药治疗和<20mg他克莫司+150mg/kg MMF联合治疗)出现急性排斥反应，特征是有活化形态的Iba1+/CD68+小胶质细胞和CD8+ T细胞的增殖性扩张和浸润。

6，视网膜类器官移植物的功能评估：研究通过旋光性测试(OKT)评估了移植大鼠的视功能，发现与年龄匹配的非手术对照组和假手术对照组相比，在移植后2-5个月，移植眼的视力显著改善。此差异在后期时间点变得更大。然而，由于对氯胺酮麻醉的敏感性增加，许多动物在上丘电生理记录前死亡，这限制了对移植物功能的全面评估。

7，移植物在宿主视网膜中的结构整合：组织学分析显示，移植的CSC14-hESC衍生视网膜组织片段在视网膜变性宿主视网膜架构中成功整合。宿主视网膜含有钙视蛋白阳性视网膜神经节细胞和无长突细胞，以及PKCα阳性视杆双极细胞覆盖在移植物上。移植的视网膜类器官片段包含表达视紫红质的视杆光感受器，在玫瑰花状结构中心有强烈的视紫红质阳性外段。此外，人源性突触小体蛋白(hSyn)与Ku80阳性细胞共定位，仅在移植区域表达，但在非移植区域不表达，这表明视网膜类器官移植细胞具有功能性突触间传递和中间神经元信号转导的潜力。一部分Ku80阳性移植细胞迁移到宿主视网膜中，hSyn阳性移植突起延伸到宿主的内丛状层。研究者观察到在恢复素阳性供体光感受器、宿主双极中间神经元和宿主/移植物Müller胶质细胞的突起之间存在紧密对位关系。

全文总结

本研究证明了免疫抑制在视网膜移植和人干细胞疗法中的可行性和有效性。通过适当的免疫抑制方案，视网膜类器官移植可在免疫功能完整的视网膜变性模型中长期存活并整合功能。研究确定了他克莫司和霉酚酸酯的最低有效治疗阈值，证明针对性的T细胞抑制可产生类似于免疫缺陷移植接受者的理想免疫组织学特征，从而促进移植光感受器的存活和功能。急性排斥仅在未接受免疫抑制的免疫功能完整大鼠中观察到。尽管存在药物对麻醉敏感性增加的限制，但本研究为临床应用提供了宝贵见解，表明干细胞衍生光感受器移植联合免疫抑制策略可能是治疗视网膜变性疾病的有效方法，为晚期患者带来新希望。未来研究应继续优化免疫抑制方案，以提高移植物恢复能力并降低风险。