Smad2/3 介导转化生长因子 β（TGF-β）信号传导的多种模式

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：Receptor-activated transcription factors and beyond: multiple modes of Smad2/3-dependent transmission of TGF-β signaling

中文标题：受体激活的转录因子及更多：Smad2/3 介导转化生长因子 β(TGF-β)信号传导的多种模式

发表期刊：《Journal of Biological Chemistry》

影响因子：3.9

作者单位：

1. Department of Biochemistry, Graduate School of Medicine, University of Yamanashi, Yamanashi, Japan

2. Department of Applied Pathology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, Tokyo, Japan

3. Laboratory for Cancer Invasion and Metastasis, RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, Yokohama, Japan

作者信息：

Keiji Miyazawa, Yuka Itoh, Hao Fu, Kohei Miyazono

研究背景

转化生长因子 β(TGF-β)是一种广泛分布的多效性细胞因子，通过 TGF-β I/II 型受体传导信号，其信号输出的时空特异性调控是领域关键问题。Smad 蛋白最初被鉴定为 TGF-β 家族的信号激活转录因子，通过受体丝氨酸 / 苏氨酸激酶磷酸化激活，是受体限制性效应分子。但近年研究发现，Smad 蛋白还具备转录后调控功能(如 microRNA 加工、pre-mRNA 剪接、m⁶A 甲基化)，甚至可调控线粒体功能而不依赖基因表达调控。此外，作为 TGF-β、激活素、肌抑素等配体下游的核心 R-Smad(受体调控 Smad)，Smad2 与 Smad3 序列相似度达 92%，但在胚胎发育、肿瘤进展、免疫调控等过程中功能存在显著差异。本综述系统阐述 Smad2/3 作为转录因子的经典功能及 “非转录功能”，解析其介导 TGF-β 信号的多种模式，并对比二者功能特异性与冗余性，为理解 TGF-β 信号的复杂调控及相关疾病机制提供框架。

研究方法

基因敲除 / 敲低(Smad2/3/Smad4 条件性敲除小鼠、siRNA 干扰);

载体构建(Smad 突变体、亚细胞定位载体、启动子荧光素酶报告质粒);

蛋白相互作用分析(Co-IP、邻近连接实验(PLA)、酵母双杂交)。

细胞生物学技术：

亚细胞定位观察(免疫荧光、共聚焦显微镜);

信号通路活性检测(双荧光素酶报告实验、Western blot 检测磷酸化 Smad);

细胞功能实验(增殖、凋亡、EMT、侵袭迁移检测)。

组学与高通量分析：

转录组学(RNA-seq)、染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)解析 Smad 结合靶基因;

蛋白质组学(质谱鉴定 Smad 互作蛋白);

表观遗传分析(组蛋白修饰、DNA 甲基化检测)。

体内功能验证：

条件性敲除小鼠模型(如神经特异性 Smad2 敲除、角质细胞特异性 Smad2 敲除);

肿瘤异种移植模型、纤维化模型(单侧输尿管梗阻、博来霉素诱导肺纤维化)。

实验结果

图1：TGF-β 信号传导模式及 Smad / 非 Smad 通路

图1A 对比多种信号通路的转录调控模式：

①核受体通过膜渗透性配体激活;

②Notch 通过膜内蛋白酶解释放 ICD 入核;

③STAT 通过受体关联激酶(JAK)磷酸化激活;

④Smad 通过受体丝氨酸激酶磷酸化形成异三聚体入核;

⑤CREB 依赖 cAMP 激活 PKA 磷酸化;

⑥NF-κB 通过 IκB 降解释放。

图 1B 解析 TGF-β 的 Smad 与非 Smad 通路：Smad 通路(左侧)中，TGF-β 结合 I/II 型受体后，I 型受体磷酸化 Smad2/3，与 Smad4 形成复合物入核，调控基因转录，同时可调控 miRNA 加工、pre-mRNA 剪接及 m⁶A 甲基化，还能激活 PKA;非 Smad 通路(右侧)主要从小窝区传导，依赖 TRAF4/6、Shc、Src 等分子，激活 PKA、RhoA、MAPK 等通路，占比 > 90% 但信号强度较低，且部分通路(如 ERK、p38)在晚期会转为 Smad 依赖。

图2：Smad 蛋白的结构与激活机制

图2A 展示 Smad 家族核心成员结构：

Smad2(467aa)、Smad2Δexon3(缺失 exon3，具备 DNA 结合能力)、Smad3(425aa)均含 N 端 MH1 结构域(蓝色)、中间 Linker 区、C 端 MH2 结构域(红色)，Smad4 含 SS 基序而非 SSXS;IRF-3 作为对照，C 端含 MH2 样结构域。

图 2B 解析 Smad 激活过程：

静息状态下，Smad2/3 处于 MH1-MH2 互作的自抑制 “闭合态”;TGF-β 刺激后，I 型受体磷酸化其 C 端 SSXS motif，转为 “开放态”，与 Smad4(需 GTP 结合 Arl15 激活)形成异三聚体;PPM1A/PP2Cα 或 MTMR4 可通过去磷酸化灭活 Smad。

图 2C 显示 Smad 结合蛋白通过 MH2 域疏水补丁互作：

SARA、c-Ski、CBP、FoxH1 分别通过不同组合的疏水补丁(A1、B1、B2 等)与 Smad 结合，如 SARA 依赖 A1/B1/B2，c-Ski 依赖 A1/A3，且结合具有条件特异性(如 SARA 结合未磷酸化 Smad，CBP 结合激活态 Smad)。

图3：Smad2/3 依赖的转录调控多种模式

图3 总结 Smad2/3 介导转录调控的核心机制：

①“先锋因子辅助” 模式(图 3A)：胚胎发育相关转录因子(如 Oct4、MyoD)先结合染色质打开异染色质，促进 Smad 复合物结合邻近位点;

②“协同 DNA 结合” 模式(图 3B)：Smad 与辅因子(如 Sp1、FoxH1)共同结合靶基因调控区，Smad 无需直接结合 DNA;

③“自增强” 模式(图 3C)：TGF-β 诱导 Smad 辅因子(如 c-Jun、ATF3)表达，后者再与 Smad 协同调控晚期靶基因;

④“抑制复合物” 模式(图 3D)：Smad2/3 与 E2F4/p107 形成复合物，抑制 c-Myc 等促增殖基因;

⑤“非 DNA 结合调控” 模式(图 3E)：Smad 与 Sp1、GATA-3 等互作，通过招募共激活因子调控转录;

⑥“复合物解离” 模式(图 3F)：Smad3 与 MyoD 互作，破坏其功能复合物抑制肌分化;

⑦“去抑制” 模式(图 3G)：静息时 Smad4 与 c-Ski/SnoN 形成抑制复合物，TGF-β 激活后 Smad2/3 竞争性结合 Smad4，解除抑制并激活靶基因。

图4：Smad2 与 Smad3 的磷酸化位点及调控激酶

图4 系统梳理 Smad2/3 的磷酸化修饰位点及对应激酶：

①Smad2(图 4A)：C 端 Ser465/467 由 ALK4/5/7 磷酸化激活;Linker 区 Thr8 由 CDK2 磷酸化(抑制 Smad4 结合)、Ser250/255 由 JNK 磷酸化(增强侵袭)、Thr220 由 CDK8/9 磷酸化(促进降解);

②Smad3(图 4B)：C 端 Ser423/425 由 ALK4/5/7 激活;Linker 区 Thr179 由 ERK/CDK8/9 磷酸化(调控 Pin1 结合)、Ser208/213 由 JNK 磷酸化(抑制 p15 启动子)、Ser309/Thr388 由 PKG 磷酸化(抑制核转位)。不同激酶介导的磷酸化可通过调控 Smad 核定位、互作蛋白结合或降解，实现信号交叉调控(如 Ras-ERK 通路通过 Linker 磷酸化抑制 Smad3)。

研究结论

Smad2/3 是 TGF-β 信号的核心效应分子，不仅作为受体激活转录因子(可依赖 Smad4 或与 TRIM33 等形成复合物调控基因)，还能通过调控 RNA 加工、线粒体融合发挥非转录功能;二者虽序列相似，但 Smad2 对胚胎发育和神经发生关键，Smad3 主导纤维化、肿瘤进展及免疫调控(如 Treg/Th17 分化)，仅在部分过程(如 Treg 诱导)存在功能冗余，且其功能受磷酸化等翻译后修饰及 lncRNA 调控，这些发现为相关疾病靶向治疗提供了 Smad2/3 相关潜在靶点。