不杀细胞也能抗 HBV？IFI27 的 “绝招”：靶向 C/EBPα 泛素化降解

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Interferon alpha-inducible protein 27 (IFI27) inhibits hepatitis B virus (HBV) transcription through downregulating cellular transcription factor C/EBPα

中文标题：干扰素 α 诱导蛋白 27(IFI27)通过下调细胞转录因子 C/EBPα 抑制乙型肝炎病毒(HBV)转录

发表期刊：《Journal of Virology》

影响因子：3.8

作者单位：

1. Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, Pennsylvania, USA.2. Cancer Virology Program, Hillman Cancer Center, University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, Pennsylvania, USA.3. Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, Aarhus, Denmark.4. Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, Pennsylvania, USA.5. Department of Electrical and Computer Engineering, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, Pennsylvania, USA.

作者信息：

Xiaoyang Yu, Cheng-Der Liu, Sheng Shen, Elena S. Kim, Zhentao Liu, Hu Zhang, Ning Sun, Yuanjie Liu, Pia M. Martensen, Yufei Huang, Haitao Guo(注：Xiaoyang Yu、Cheng-Der Liu、Sheng Shen 对本研究贡献均等)

研究背景

干扰素 α(IFNα)是慢性乙型肝炎(CHB)治疗中唯一获批的免疫调节药物，通过诱导干扰素刺激基因(ISGs)发挥抗病毒作用，但关键抗 HBV 的 ISG 及其机制尚未完全明确。IFI27(干扰素 α 诱导蛋白 27)是 FAM14 基因家族成员，此前已发现其对 HCV、西尼罗河病毒等有抗病毒活性，且初步观察到其可降低 HBV RNA 水平，但具体机制未知。HBV 转录依赖宿主转录因子(如 C/EBPα、HNF4α)，其中 C/EBPα 可结合 HBV 增强子 Ⅱ 和核心启动子，促进病毒转录。本研究旨在明确 IFI27 对 HBV 的抑制作用及机制，探索其是否通过调控宿主转录因子影响 HBV 复制，为 CHB 治疗提供新靶点。

研究方法

细胞与试剂：

细胞：HepG2、Huh7(肝癌细胞系)、HepG2-NTCP(支持 HBV 感染的细胞系)、原代人肝细胞(PHH);

试剂：IFNα、HBV 感染性病毒颗粒(HepAD38 细胞上清制备)、蛋白酶体抑制剂 MG132、蛋白合成抑制剂环己亚胺(CHX)、siRNA(靶向 IFI27、C/EBPα、SKP2)、HBV 复制质粒(pHBV1.3、pCMVHBV)及启动子荧光素酶报告质粒(EnII/Cp-Luc、S1p-Luc 等)。

IFI27 诱导与表达验证：

IFNα 处理 HepG2-NTCP 和 PHH，通过 RNA-seq、qRT-PCR、Western blot 检测 IFI27 的时间(6-96h)和剂量(10-1000 IU/mL)依赖性表达。

HBV 复制抑制实验：

过表达 / 敲低 IFI27，通过 Northern blot 检测 HBV RNA(3.5kb pgRNA、2.4/2.1kb 表面蛋白 RNA)，Southern blot 检测 HBV 核心 DNA，评估病毒复制水平;MTT 法检测细胞毒性，排除凋亡相关抑制。

转录机制验证：

双荧光素酶报告实验检测 IFI27 对 HBV 启动子(EnII/Cp、S1p、S2p)活性的影响;

RNA-seq 分析 IFI27 对宿主转录组的影响，qRT-PCR 验证差异基因(如 CXCL8);

Western blot 检测 C/EBPα 等转录因子的蛋白水平，CHX 追踪蛋白稳定性，MG132 验证泛素 - 蛋白酶体降解途径;

ChIP-qPCR 检测 C/EBPα 与 HBV 基因组的结合效率;

Co-IP 验证 C/EBPα 的泛素化，siRNA 敲低 SKP2(E3 泛素连接酶)评估其对 IFI27-C/EBPα 轴的影响。

体内外功能验证：

HepG2-NTCP 细胞 HBV 感染模型中，敲低 IFI27 后检测 IFNα 的抗病毒效果;

过表达 C/EBPα 验证其对 IFI27 抗 HBV 作用的逆转效应。

实验结果

图1：IFI27 被 IFNα 诱导表达

图1 通过多维度验证 IFI27 的 IFNα 诱导特性：RNA-seq 热图显示，IFNα(1000 IU/mL)处理 HepG2-NTCP 细胞 36h 后，IFI27 是差异上调最显著的干扰素刺激基因(ISG)之一(图 1A);qRT-PCR 证实 HepG2 细胞中 IFI27 mRNA 随 IFNα 处理时间(6-48h)延长而递增，48h 达峰值(图 1B)，且在原代人肝细胞(PHH)中随 IFNα 浓度(10-1000 IU/mL)升高呈剂量依赖性上调(图 1C);Western blot 进一步显示 IFNα 处理后 IFI27 蛋白在 12-96h 内持续表达，明确 IFNα 可通过时间和剂量双重调控诱导 IFI27 表达。

图2：IFI27 通过减少 HBV RNA 抑制病毒复制

图2 在转染和感染模型中验证 IFI27 的抗 HBV 效应：HepG2/Huh7 细胞共转染 pHBV1.3 与 IFI27 后，Northern blot 显示 HBV 总 RNA(3.5kb pgRNA、2.4/2.1kb 表面蛋白 RNA)减少约 50%，Southern blot 显示代表新合成病毒 DNA 的 ssDNA 同步降低(图 2A-B);siRNA 敲低内源性 IFI27 后，HBV 3.5kb RNA 水平升高约 24%，证实 IFI27 是 HBV 的内源性限制因子(图 2C);HepG2-NTCP 细胞感染 HBV 后过表达 IFI27，同样观察到 HBV RNA 和 ssDNA 减少，且 rcDNA(主要来自接种病毒)无显著变化，排除对病毒颗粒的直接影响(图 2D)。

图3：IFI27 的亚细胞定位及无细胞毒性

图3 明确 IFI27 的作用位置及安全性：免疫荧光显示，FLAG 标记的 IFI27 主要定位于 HepG2 细胞细胞质，部分与线粒体(MitoTracker 红色标记)共定位，细胞核中无明显信号(图 3A);MTT 细胞活力实验表明，过表达 IFI27 的 HepG2 细胞存活率与对照组无统计学差异(p>0.05)，排除 IFI27 通过诱导细胞凋亡抑制 HBV 的可能性，证实其特异性抗病毒作用(图 3B)。

图4：IFI27 抑制 HBV 启动子活性

图4 聚焦 IFI27 对 HBV 转录的调控机制：通过对比 pHBV1.3(依赖 HBV 自身 EnII/Cp 启动子)和 pCMVHBV(依赖 CMV-IE 启动子)，发现 IFI27 仅降低 pHBV1.3 的 HBV RNA 水平，对 pCMVHBV 无影响，证实其不作用于 RNA 稳定性，而是靶向病毒自身启动子(图 4A-B);双荧光素酶报告实验显示，IFI27 不影响 CMV-IE 启动子活性，却显著抑制 EnII/Cp、S1p、S2p 等 HBV 启动子的荧光素酶活性(降低 50%-70%)，明确其通过抑制 HBV 启动子减少转录(图 4C-D)。

图5：内源性 IFI27 介导 IFNα 的抗 HBV 效应

图5 验证 IFI27 在 IFNα 抗 HBV 中的必要性：siRNA 敲低 IFI27 后，IFNα 诱导的 IFI27 mRNA 水平下降 87.2%(图 5A);Northern blot 和 qRT-PCR 显示，IFNα 可使对照组 HepG2-NTCP 细胞的 HBV 3.5kb RNA 减少约 52%，而敲低 IFI27 后，IFNα 的抗病毒效果显著减弱，HBV pC mRNA 仅减少约 18%，证实内源性 IFI27 是 IFNα 发挥抗 HBV 作用的关键介质(图 5B-C)。

图6：IFI27 不显著改变宿主转录组

图6 排除 IFI27 通过调控宿主全局转录发挥作用：qRT-PCR 显示，过表达 IFI27 后，C/EBPα、HNF4α 等 HBV 相关转录因子的 mRNA 水平无显著变化(图 6A);RNA-seq 火山图显示，IFI27 仅轻微改变宿主转录组，仅 CXCL8(IL-8)等少数基因上调(log2FC>1)(图 6B);进一步验证发现，过表达或外源性添加 IL-8 均不影响 HBV RNA 水平，排除 IL-8 介导 IFI27 抗病毒作用的可能(图 6C-E)。

图7：IFI27 降低 C/EBPα 蛋白水平

图7 揭示 IFI27 对 C/EBPα 的调控作用：Western blot 显示，过表达 IFI27 后，C/EBPα 蛋白(p42/p30 亚型)水平降低，且环己亚胺(CHX)处理加速其降解(48h 降低约 60%)(图 7A);IFNα 处理 HepG2 细胞后，IFI27 上调伴随 C/EBPα 蛋白减少，证实 IFNα 通过 IFI27 下调 C/EBPα(图 7B);细胞分馏实验显示，IFI27 主要降低细胞质中 C/EBPα(减少约 45%)，进而导致细胞核中 C/EBPα 减少(减少约 40%)，影响其对 HBV 启动子的结合(图 7C)。

图8：C/EBPα 介导 IFI27 的抗 HBV 作用

图8 证实 C/EBPα 是 IFI27 抗 HBV 的关键靶点：ChIP-qPCR 显示，过表达 IFI27 后，C/EBPα 与 HBV 基因组的结合效率降低约 50%，而 H3K27ac(内参)无变化(图 8A);过表达 C/EBPα 显著增强 HBV 启动子活性，且使 HBV 3.5kb RNA 升高约 43%，敲低 C/EBPα 则使 RNA 降低约 30%，证实 C/EBPα 促进 HBV 转录(图 8B-D);关键的逆转实验显示，过表达 C/EBPα 可完全逆转 IFI27 对 HBV RNA 的抑制，进一步确认 C/EBPα 的核心作用(图 8E)。

图9：IFI27 通过 SKP2 介导 C/EBPα 泛素化降解

图9 解析 IFI27 下调 C/EBPα 的分子机制：蛋白酶体抑制剂 MG132 处理后，IFI27 介导的 C/EBPα 降解被完全阻断，证实依赖泛素 - 蛋白酶体途径(图 9A);Co-IP 实验显示，过表达 IFI27 后，C/EBPα 的泛素化水平升高约 3 倍，MG132 处理后泛素化产物积累(图 9B);siRNA 敲低 E3 泛素连接酶 SKP2 后，IFI27 无法降低 C/EBPα 蛋白水平，且其对 HBV RNA 的抑制作用减弱约 60%，证实 SKP2 是 IFI27 介导 C/EBPα 降解的必需因子(图 9C-D)。

图10：IFI27 抗 HBV 机制模型

图10 概括 IFI27 抗 HBV 的完整通路：IFNα 与肝细胞表面 IFNAR1/2 结合，激活 JAK-STAT 信号通路诱导 IFI27 表达;IFI27 定位于细胞质，招募 E3 泛素连接酶 SKP2，促进细胞转录因子 C/EBPα 的泛素化降解;细胞质中 C/EBPα 减少导致细胞核内可结合 HBV 启动子的 C/EBPα 不足，最终抑制 HBV 转录，减少病毒 RNA 合成，发挥抗病毒作用。

研究结论

本研究证实，干扰素 α 诱导蛋白 27(IFI27)是 IFNα 抗乙型肝炎病毒(HBV)的关键干扰素刺激基因(ISG)：IFNα 可时间和剂量依赖性诱导 IFI27 表达，IFI27 通过泛素 - 蛋白酶体途径，在 E3 泛素连接酶 SKP2 的介导下促进细胞转录因子 C/EBPα 的泛素化降解，减少 C/EBPα 在细胞核内与 HBV 启动子(EnII/Cp、S1p 等)的结合，从而抑制 HBV 转录及 RNA 合成，最终发挥抗 HBV 作用;内源性 IFI27 是 IFNα 抗 HBV 效应的重要介质，敲低 IFI27 会显著减弱 IFNα 的抗病毒效果，且 IFI27 不影响宿主全局转录组，无细胞毒性，其调控的 IFI27-SKP2-C/EBPα 轴为慢性乙型肝炎的治疗提供了新的潜在靶点，也为 IFNα 治疗机制提供了新的解释。