PMA+H₂O₂ 协同激活 HIV-1 LTR，PKC 抑制剂或成调控关键

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Activation of the Human Immunodeficiency Virus-1 Long Terminal Repeat by Respiratory Burst Oxidants of Neutrophils

中文标题：中性粒细胞呼吸爆发氧化剂激活人类免疫缺陷病毒 1 型长末端重复序列

发表期刊：《Blood》

影响因子：23.1

作者单位：

Department of Medicine, University of Washington, Seattle, WA 98195-7185, USA

作者信息：

Seymour J. Klebanoff, Catherine M. Headley

研究背景

人类免疫缺陷病毒 1 型(HIV-1)的长末端重复序列(LTR)是病毒基因转录的关键调控区，其激活直接影响病毒复制。中性粒细胞等吞噬细胞受刺激后会发生 “呼吸爆发”，产生超氧阴离子(O₂⁻)并转化为过氧化氢(H₂O₂)，此前研究证实该过程产生的氧化剂可通过过氧化物酶 - H₂O₂- 卤化物系统发挥抗 HIV-1 活性，但 H₂O₂是否反向激活 HIV-1 LTR 尚未明确。本研究以稳定整合 HIV-1 LTR - 荧光素酶报告基因的 Jurkat T 细胞(Jurkat LTR-luc)为模型，探究中性粒细胞呼吸爆发产生的 H₂O₂对 HIV-1 LTR 的激活作用，以及佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA，蛋白激酶 C 激活剂)、调理酵母聚糖(吞噬刺激剂)等对该过程的调控机制。

研究方法

细胞与试剂：

细胞：Jurkat LTR-luc 细胞(稳定整合 HIV-1 LTR - 荧光素酶)、正常中性粒细胞(健康志愿者外周血分离，>97% 纯度)、慢性肉芽肿病(CGD)患者中性粒细胞(无呼吸爆发功能)。

试剂：PMA(PKC 激活剂)、调理酵母聚糖(吞噬刺激剂)、过氧化氢酶(降解 H₂O₂)、钒酸盐(增强 H₂O₂生物活性)、叠氮化物(抑制过氧化物酶 / H₂O₂降解)、PKC 特异性抑制剂(BIM、Go6976)，荧光素酶检测试剂盒(Promega)。

LTR 激活检测：

反应体系含 2×10⁶个 Jurkat LTR-luc 细胞、中性粒细胞(不同浓度)及刺激剂，37℃、5% CO₂孵育 6h 后，用发光仪检测荧光素酶活性(相对光单位 RLU)，反映 LTR 激活程度。

呼吸爆发检测：

用鲁米诺 / 光泽精增强化学发光法，检测中性粒细胞受 PMA / 调理酵母聚糖刺激后的氧化产物释放(RLU 值)，评估呼吸爆发强度。

统计分析：

数据以 “均值 ± 标准误(SEM)” 表示，采用 Mann-Whitney U 检验分析差异，p<0.05 为显著。

实验结果

图1：中性粒细胞 + PMA 激活 HIV-1 LTR

单独中性粒细胞(浓度 3×10⁴-10⁷/mL)对 Jurkat LTR-luc 细胞的 HIV-1 LTR 无激活作用;单独 PMA(100ng/mL)可显著激活 LTR，荧光素酶活性从背景的 20218±2725 RLU 升至 373473±65262 RLU(p<0.001)。当中性粒细胞与 PMA 联合使用时，10⁶/mL 中性粒细胞使 LTR 激活达到峰值(RLU 约 3×10⁶)，显著高于单独 PMA 组;但中性粒细胞浓度升至 10⁷/mL 时，激活强度反而降至单独 PMA 组以下。若用 CGD 患者的中性粒细胞(无呼吸爆发功能)替代正常中性粒细胞，即使联合 PMA 也无法激活 LTR，证实 LTR 激活依赖中性粒细胞呼吸爆发产生的产物。

图2：PMA 剂量效应曲线

单独 PMA 在浓度低至 1ng/mL 时即可显著激活 LTR;当联合 10⁶/mL 中性粒细胞时，PMA 浓度≥3ng/mL 时的 LTR 激活强度显著高于相同浓度单独 PMA 组。无论 PMA 浓度如何(0.1-100ng/mL)，若中性粒细胞浓度升至 10⁷/mL，LTR 激活强度均会下降，提示高浓度中性粒细胞可能产生与呼吸爆发无关的抑制性物质，抵消 PMA 的激活效应。

图3：过氧化氢酶抑制 LTR 激活

过氧化氢酶(8.2μg/mL)对单独 PMA 或单独中性粒细胞诱导的 LTR 活性无影响，但可显著抑制 “10⁶/mL 中性粒细胞 + PMA” 组合的 LTR 激活，使荧光素酶活性降至单独 PMA 组水平;加热失活的过氧化氢酶无此抑制作用。超氧化物歧化酶(SOD，1μg/mL)对所有实验组的 LTR 激活均无影响，表明 LTR 激活依赖中性粒细胞呼吸爆发产生的 H₂O₂，而非超氧阴离子。

图4：钒酸盐增强低浓度中性粒细胞的 LTR 激活

钒酸盐(3×10⁻⁵mol/L)对 “10⁶/mL 中性粒细胞 + PMA” 的 LTR 激活无显著影响，但可显著增强 “10⁵/mL 中性粒细胞 + PMA” 组合的 LTR 激活(p<0.05)。这是因为钒酸盐可与 H₂O₂形成生物活性更强的复合物，补偿低浓度中性粒细胞呼吸爆发产生的 H₂O₂不足，从而提升 LTR 激活效率。

图 5：叠氮化物对 LTR 激活的双向调控

图 5A(PMA 刺激)显示，低浓度叠氮化物(3×10⁻⁶mol/L)可增强 “中性粒细胞 + PMA” 的 LTR 激活，高浓度叠氮化物(10⁻⁴-10⁻³mol/L)则抑制激活;叠氮化物对单独 PMA 无影响，且对 CGD 中性粒细胞 + PMA 组合无增强作用，说明其通过抑制过氧化物酶活性、减少 H₂O₂降解发挥作用。图 5B(调理酵母聚糖刺激)显示，单独 “中性粒细胞 + 调理酵母聚糖” 仅轻微激活 LTR(RLU 26578±5728)，加入叠氮化物(3×10⁻⁵mol/L)后激活显著增强(RLU 252483±104399)，且该效应被过氧化氢酶抑制、CGD 中性粒细胞无此效应，证实调理酵母聚糖诱导的 H₂O₂需叠氮化物抑制降解才足以激活 LTR。

图 6：H₂O₂与 PMA 的协同激活作用

单独 H₂O₂(最适浓度 10⁻⁴mol/L)使 LTR 荧光素酶活性从背景 23379 RLU 升至 110956 RLU，单独 PMA(100ng/mL)升至 403823 RLU;当两者联合使用时，荧光素酶活性达 3096165 RLU，显著高于两者单独效应之和(p<0.005)。而 TNF-α(100U/mL)或 IL-2(100U/mL)与 H₂O₂无协同激活作用，证实 PMA 与 H₂O₂的协同效应具有特异性，依赖 PMA 介导的信号通路。

图 7：PKC 抑制剂抑制 LTR 激活

PKC 特异性抑制剂 BIM 在 10⁻⁷mol/L 浓度时，即可显著抑制 PMA、H₂O₂、“H₂O₂+PMA” 及 “中性粒细胞 + PMA” 诱导的 LTR 激活;Go6976 抑制效果较弱，需 10⁻⁶mol/L 才显效。两种抑制剂对 TNF-α 诱导的 LTR 激活均无影响，表明 PKC 不仅参与 PMA 直接激活 LTR 的过程，还介导 H₂O₂对 LTR 的激活，且该调控具有通路特异性。

图 8：BIM 对中性粒细胞呼吸爆发的影响

鲁米诺增强化学发光(主要反映过氧化物酶催化反应)显示，调理酵母聚糖刺激的中性粒细胞发光强度高于 PMA 刺激组，BIM 对 PMA 诱导的发光几乎完全抑制，对调理酵母聚糖诱导的发光仅抑制约 50%;光泽精增强化学发光(主要反映超氧阴离子释放)显示，PMA 刺激的发光强度高于调理酵母聚糖组，BIM 对 PMA 诱导的发光完全抑制。这表明 PMA 通过 PKC 激活中性粒细胞呼吸爆发，而调理酵母聚糖的激活途径部分不依赖 PKC。

研究结论

本研究发现，中性粒细胞呼吸爆发产生的 H₂O₂是激活 HIV-1 LTR 的关键，CGD 患者无呼吸爆发的中性粒细胞无法激活 LTR，过氧化氢酶可阻断该过程;PMA 通过直接激活 LTR、诱导中性粒细胞产 H₂O₂、与 H₂O₂协同(PKC 介导)三重机制增强激活;调理酵母聚糖需叠氮化物抑制 H₂O₂降解才显激活作用;且中性粒细胞对 HIV-1 有 “杀病毒”(过氧化物酶系统)和 “促复制”(H₂O₂激活 LTR)的双重效应，为 HIV-1 免疫调控提供依据。