人源多能干细胞衍生肠道类器官用于药代动力学研究

肠道作为人体重要的生理屏障，对口服药物的吸收、代谢和排泄起着至关重要的作用。长期以来，由于缺乏合适的人源肠上皮细胞体外模型，药物开发过程中的药代动力学研究主要依赖动物模型和人源结肠癌细胞系Caco-2细胞。然而，这些模型存在明显缺陷：动物模型与人类之间存在种属差异，无法准确反映人类肠道对药物的代谢吸收特性;而Caco-2细胞作为源自人类结肠癌的细胞系，其药物代谢酶(如CYP3A4)的表达水平显著低于正常肠上皮细胞，因此也不能作为可靠的人源肠上皮细胞模型。人源诱导多能干细胞(hiPSC)来源的肠上皮细胞(IECs)为评估候选药物提供了一个有价值的体外模型，但现有的hiPSC分化为肠上皮细胞的方法通常需要多步骤分化过程，耗时较长。

近年来，肠道类器官(IO)研究的进展为理解成人干细胞维持所需的生长因子提供了新的视角。在这项研究中，研究人员建立了一种简便可行的方法，利用直接三维集群培养从hiPSCs衍生具有高自我增殖能力的肠道类器官(iPSC-IOs)，可长期增殖并保持分化能力，且能够冷冻保存，为药代动力学研究提供了理想的体外模型系统。相关研究结果以题为Human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids for pharmacokinetic studies发布在European journal of cell biology期刊。

图示描述

1，研究团队采用三维集群培养方法，成功从人源诱导多能干细胞(hiPSCs)衍生出肠道类器官(iPSC-IOs)。首先，研究者将冻存的hiPSC细胞解冻后接种到六孔板的微凹插入物上，进行三维集群培养。通过添加Activin A诱导内胚层分化，之后通过添加FGF4和CHIR99021促进后部化形成中/后肠，最终将细胞嵌入Matrigel中，在含有商业化S3培养基的环境下形成肠道类器官。qPCR结果显示，随着分化的进行，内胚层标记物SOX17在分化第3天上调至成人小肠(ASI)的10倍以上，后肠标记物CDX2在第8天上调并在第15天达到与ASI相似的水平。干细胞标记物LGR5从第3天开始上调并维持在高于ASI的水平，肠上皮细胞标记物VILLIN1(VIL1)表达逐渐增加，在第29天达到与ASI相似的水平。

图1 人iPSCs分化为肠类器官(IO)

2，研究发现，iPSC-IOs在商业化S3培养基中的自我复制能力有限，在P7左右停止生长。为解决这一问题，研究团队在P5时将培养基更换为包含Wnt激动剂R-spondin1、EGF、Noggin等多种生长因子的S4培养基，实现了iPSC-IOs的长期扩增，P7的增长率达到约22.7倍。通过基因表达分析和免疫细胞化学检测，证实长期培养的iPSC-IOs(P11和P14)表达肠干细胞标记物LGR5，腺上皮细胞标记物VIL1等，且含有肠道多种分化细胞类型，包括杯状细胞(MUC2阳性)和内分泌细胞(CHGA阳性)。多数细胞呈Ki67阳性，表明具有良好的增殖特性。

图2 扩增hiPSC衍生的肠类器官(hiPSC-IO)

3，将iPSC-IOs接种在胶原膜(CVM)上，形成二维单层培养，并将培养基更换为肠上皮细胞成熟培养基(IEC MM)，可获得成熟的肠上皮细胞。单层培养11天后，干细胞标记物LGR5表达下降，而转运体标记物(ABCG2、ABCB1、SLC15A1)和药物代谢酶(CYP3A4、UGT1A1、CES2)上调，表达水平甚至高于ASI。跨上皮电阻(TEER)值在培养第6天达到峰值，表明形成了致密的上皮屏障。

图3 从hiPSC-IO中生成单层肠上皮细胞(IEC)

4，功能测试表明，iPSC-IO衍生的IECs具有多种CYP酶代谢活性，包括CYP1A、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A，能够将苯乙酰胺、双氯芬酸、S-甲苯妥英、布呋洛尔和咪达唑仑代谢为相应的代谢物。P-gp转运体活性测试显示，奎尼丁的B-to-A方向转运显著高于A-to-B方向(比值为2.35)，证实细胞具有功能性的药物外排能力。药物渗透性测试进一步验证了iPSC-IO衍生IECs的药代动力学应用价值，10种测试化合物的表观渗透系数(Papp)与人体肠道吸收率(FaFg)的相关性很高(R²=0.8633)，表明该模型可用于预测口服药物的肠吸收特性。

图4 在hiPSC-IO衍生的IEC中可以评估药物代谢和转运活性

5，具体来说，本研究的重要意义体现在以下几个方面：首先，iPSC-IO衍生的IECs表达多种药物转运体和代谢酶，且表达水平与成人小肠相当或更高，解决了现有模型中药物代谢酶表达不足的问题;其次，iPSC-IO衍生的IECs具有功能性的药物代谢活性和转运体活性，能够准确反映人类肠道对药物的代谢和吸收特性;第三，iPSC-IO衍生的IECs与人体肠道吸收率的高相关性(R²=0.8633)表明该模型可用于药物开发早期阶段预测口服药物的生物利用度;最后，该方法支持个体化iPSC衍生的肠道类器官构建，可用于研究药物反应的个体差异，为精准医疗提供支持。

全文总结

本研究建立了一种简便有效的方法，通过三维集群培养直接从hiPSCs衍生肠道类器官，并实现了类器官的长期扩增和冷冻保存。与传统的hiPSC分化方法相比，该方法简化了操作流程，节省了时间，解决了hiPSC衍生肠上皮细胞制备过程中的关键问题。长期培养的iPSC-IOs可以冷冻保存，需要时解冻并接种于二维培养表面，在短期培养(11天)后获得成熟的肠上皮细胞，包含肠道多种细胞类型，可用于药代动力学研究。总之，本研究开发的iPSC衍生肠道类器官模型为药物开发中的药代动力学研究提供了更加接近人体生理状态的体外模型系统，有助于提高药物开发效率，降低药物开发成本，减少临床试验失败风险，加速新药研发进程。