iPSC来源的肝脏类器官作为研究中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症的工具

中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCADD)是一种常见的脂肪酸氧化障碍，在荷兰的发病率约为1/8300。该疾病由ACADM基因的双等位基因变异引起，其中c.985A>G (p.K329E)是最常见的致病变异。有趣的是，即使具有相同的基因型，患者的临床表现也可能存在显著差异，从完全无症状到严重的低酮性低血糖症。这种异质性的潜在机制尚不清楚。啮齿动物模型研究的局限性在于，它们具有与MCAD底物特异性重叠的额外脱氢酶(LCAD)，可能掩盖表型。此外，基因的完全缺失无法阐明ACADM基因中特定点突变的影响。因此，人源患者特异性的体外模型成为研究MCADD的有吸引力的替代选择。类器官是在体外增殖的三维多细胞结构，能够重现器官起源的多种功能。iPSC来源的肝脏类器官可通过微创手术获得，为建立患者特异性疾病模型提供了重要的平台。

近期，发布在Journal of inherited metabolic disease期刊，题为iPSC-Derived Liver Organoids as a Tool to Study Medium Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency的研究旨在建立和表征iPSC来源的肝胆类器官系统，用于研究MCADD疾病机理和患者间的表型差异。

图示描述

1，患者特异性iPSC的建立和肝脏类器官的分化：研究团队从经典c.985A>G (p.K329E)突变的有症状MCADD患者和健康对照者的成纤维细胞中重编程获得了iPSC。免疫荧光证实了这些iPSC表达多能性标记物NANOG、OCT4、SOX2、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81。随后，研究人员使用改良的分化方案将iPSC分化为可扩增肝脏类器官(EHO)。在分化过程中观察到细胞形态的变化，其中大多数类器官呈囊性并含有明确的腔隙，部分形成"小叶样"结构。EHO可以冷冻保存，并在解冻后经过几代继续培养而不会出现明显的形态学变化。

图1 从iPSCs生成人类可扩展肝类器官(EHOs)的方案

2，肝脏类器官的表征：研究者通过基因表达谱分析评估了类器官在不同发育阶段的细胞特性。在分化过程中，内胚层特异性标记物SOX17、FOXA2、GATA4和GATA6均在确定性内胚层(DE)阶段被诱导。早期肝脏特化标记物TBX3和HNF4-α在DE阶段就已观察到，但在EHO阶段达到峰值。胎儿肝细胞标记物α-甲胎蛋白(AFP)在EHO阶段表达达到峰值，而肝脏标记物白蛋白在肝母细胞(HB)阶段开始表达，并在EHO阶段达到最大表达，几乎与人肝组织相当。早期胆管标记物CK19和SOX19的表达表明类器官中存在多种细胞类型。功能测试表明这些类器官能够分泌白蛋白和尿素，证实了它们的"类肝脏"状态。

图2 肝脏类器官的表征

3，MCADD类器官的生化表型：为了刺激脂肪酸代谢，研究人员用牛血清白蛋白(BSA)或BSA结合的棕榈酸处理类器官24小时。对照类器官显示MCAD蛋白存在，而MCADD患者的类器官中检测不到MCAD蛋白，这与c.985A>G (p.K329E)变异使蛋白质不稳定的事实一致。有趣的是，类器官在使用辛酰肉碱(C8-酰基肉碱)作为底物时的氧消耗率与文献报道的原代组织来源的类器官和肝细胞系HepG2相当，但MCADD类器官与对照组之间没有显著差异。计算模型分析表明，这可能是由于SCAD和VLCAD部分补偿MCAD缺乏所致。酰基肉碱谱分析显示，MCADD类器官积累了中链酰基肉碱(C6-C10)，其C8/C10比值显著升高，这与MCADD患者的主要生化表型一致。

图3 MCADD EHO类器官在培养中表现出MCADD特征表型

4，类器官的成熟和过氧化物酶体丰度增加：为了促进过氧化物酶体增殖，研究者将EHO进一步分化为成熟EHO(Mat-EHO)。EHO在扩增培养基中维持4-5天后转入成熟培养基，导致形态变化，尺寸缩小并发展出更厚的外缘。成熟通过成熟肝细胞标记物HNF4-α、AFP、白蛋白和CYP2C9的上调得到确认，而胆管细胞标记物TBX3和CK19的表达降低。此外，参与过氧化物酶体脂肪酸氧化的基因(ABCD1、ACOX1和CROT)显著上调。Mat-EHO向培养基分泌的白蛋白水平也高于EHO，这与更接近肝细胞样表型一致。

图4 EHO成熟为Mat-EHO

5，MCADD Mat-EHO中脂肪酸β和ω氧化的适应性：在MCADD Mat-EHO中，发现线粒体β-氧化相关酶基因如中链酮酰辅酶A硫解酶(MCKAT)、羟酰辅酶A脱氢酶(M/SCHAD)和肉碱/酰基肉碱载体蛋白(CACT)相比对照组均下调。与预期相反，参与过氧化物酶体β-氧化的基因表达除ACOX1有非显著下降外，其他基因表达无显著变化。此外，参与长链脂肪酸ω-氧化的细胞色素P450家族4亚家族F成员2(CYP4F2)和醇脱氢酶4(ADH4)在MCADD Mat-EHO中下调。值得注意的是，在无糖条件下，MCADD Mat-EHO氧消耗率(OCR)比对照组更高，这种差异在基线和加入丙二酸和ADP后就已观察到。与此一致，参与三羧酸(TCA)循环的苹果酸脱氢酶(MDH2)在MCADD类器官中上调。此外，MCADD Mat-EHO中短链酰基肉碱(C2)和长链肌丽酰肉碱(C14)水平降低，与基于人类脂肪酸氧化动力学模型的计算预测一致。

图5 Mat-EHO类器官在无葡萄糖培养基中补充BSA和L-肉碱培养24小时，观察MCADD中线粒体和过氧化物酶体β-氧化和ω-氧化的适应性

6，MCADD Mat-EHO中辅酶A代谢变化：研究检测了MCADD类器官中总CoA池(游离CoA加酰基CoA)，发现其与对照组无显著差异。在CoA合成通路中，线粒体泛酸激酶同工型基因PANK2在MCADD类器官中轻微但显著下调。此外，肉碱酰基转移酶和过氧化物酶体CoA回收相关酶基因如CROT和肉碱乙酰转移酶(CRAT)在MCADD类器官中表达显著降低。有趣的是，Nudix水解酶7(NUDT7)基因在MCADD类器官中明显上调。该基因编码的过氧化物酶体Nudix水解酶能够水解CoA和酰基CoA物质，在二羧酸脂肪酸代谢中起作用。蛋白质水平分析显示，与mRNA模式一致，CRAT在MCADD Mat-EHO中下调，但CROT和NUDT7蛋白质水平在两组间无显著差异。

图6 Mat-EHOs中的CoA代谢

全文总结

本研究成功建立了MCADD患者特异性的iPSC来源肝脏类器官系统，这些类器官复现了疾病的主要生化表型：中链酰基肉碱的积累和升高的C8/C10比值。此外，成熟的类器官表达了与潜在补偿机制相关的代谢通路，尤其是辅酶A代谢和TCA循环。特别是NUDT7表达的上调可能在防止MCADD中二羧酸脂肪酸过度积累方面发挥作用。这种患者特异性肝脏类器官系统为研究MCADD患者间的表型异质性提供了有前景的平台。Mat-EHO作为一种接近肝细胞样的模型，其与过氧化物酶体和线粒体富集相关的成熟性，以及具有代表性的酰基肉碱谱，使其成为研究MCADD病理生理机制的相关工具。这种模型可用于评估ACADM基因不同变异的影响，以及研究有症状和无症状患者之间潜在的补偿机制。未来，该模型还可用于探索营养干预和不同应激因素的影响，以及潜在的治疗策略，为MCADD的个体化治疗提供新的见解。