用患者衍生的类器官设计放射抵抗性直肠癌的替代治疗选择

放射治疗在肿瘤治疗中扮演着至关重要的角色，但放射抵抗性依然是一个严峻的挑战。放射线通过直接电离DNA或间接产生活性氧自由基(ROS)来损伤DNA和其他关键细胞组分，从而诱导细胞死亡。癌细胞发展出放射抵抗性的机制既包括非细胞自主性因素(如缺氧、成纤维细胞的存在和抗癌免疫应答)，也包括细胞自主性因素(如高效的DNA修复能力和细胞代谢的重编程)。由于这些特征为癌细胞在接受放射治疗时提供了生存优势，它们也可能成为潜在的治疗靶点。

肿瘤来源的类器官培养是研究放射抵抗性的理想模型，因为它们保留了原发肿瘤的特征并可稳定传代。最近的研究表明，类器官对放射线的体外敏感性与临床放射治疗反应具有良好的相关性。在之前的研究中，作者证明了原发性直肠癌来源的类器官暴露于临床相关的放射剂量下，表现出异质性反应;而且类器官的体外放射敏感性与相应患者的无进展生存期相关：放射抵抗性类器官的患者术后进展时间早于放射敏感性类器官患者。

近期，发布在British journal of cancer期刊，题为Rational design of alternative treatment options for radioresistant rectal cancer using patient-derived organoids的研究中，研究人员从之前的队列中选择了两种放射抵抗性类器官和两种放射敏感性类器官，通过RNA测序比较它们的基因表达差异，并基于测序结果设计并筛选了药物组合，以期开发针对放射抵抗性直肠癌的替代治疗策略。

图示描述

1，鉴定放射抵抗性和放射敏感性直肠癌患者来源的类器官：研究人员从之前的研究中选择了两个最具放射抵抗性的类器官(HUB005和HUB183)和两个最具放射敏感性的类器官(HUB106和HUB062)。为验证这些类器官的不同放射敏感性，研究人员进行了两项实验。首先，将类器官暴露于5 Gy辐射剂量下，通过流式细胞术定量检测凋亡细胞(亚G1 DNA含量)。结果显示，放射抵抗性类器官(HUB005和HUB183)的凋亡细胞增加有限(分别为1.3±0.5和2.9±0.05倍)，而放射敏感性类器官(HUB062和HUB106)显示显著更高的增加(分别为5.9±0.9和11.8±0.7倍)。其次，克隆形成实验结果与上述发现一致，HUB005和HUB183保留了更高的克隆形成能力，而HUB062和HUB106则较低。

图1 基于流式细胞术的测量方法，用于测定在0和5 Gy下具有亚G1 DNA含量的(凋亡)细胞

2，放射抵抗性类器官表现出增强的转录适应性和DNA损伤响应：为了研究放射抵抗性和放射敏感性类器官对辐射的不同反应，研究人员将三天龄的类器官暴露于0或10 Gy辐射，并通过RNA测序比较它们的转录组。基因集变异分析显示，在接受辐射后，放射抵抗性类器官有469个基因集显著上调或下调，而放射敏感性类器官只有145个。放射抵抗性类器官显著上调了43个DNA修复通路相关基因集(共469个)，包括双链断裂修复如非同源末端连接和同源重组，以及与细胞周期调控相关的基因集(87/469)。相比之下，放射敏感性类器官上调的DNA修复通路较少(16/145)，细胞周期通路也较少(19/145)，但上调了与程序性细胞死亡相关的通路(11/145)。转录反应的定量分析显示，DNA修复通路在放射抵抗性类器官中的上调程度显著高于放射敏感性类器官。这些结果表明，放射抵抗性类器官具有更强的转录适应性，能够在辐射后更有效地上调DNA修复基因。

3，放射抵抗性类器官具有上调的抗氧化代谢：除了研究类器官如何响应辐射外，研究人员还比较了未经辐射的放射抵抗性和敏感性类器官之间的基因表达差异。主成分分析和层次聚类分析显示，放射抵抗性和敏感性类器官在基因表达上形成了明显不同的群组。差异基因表达分析发现了4,093个差异表达基因，其中放射抵抗性类器官上调的基因包括GSTT1(参与活性氧自由基与谷胱甘肽的结合)、CYP1A1(参与异生物解毒)、UGT1A6(与葡萄糖醛酸化相关)和ALDH3A1(参与乙醛解毒)。基因集变异分析表明，放射抵抗性类器官表现出活性氧自由基(ROS)和异生物解毒相关基因集的上调表达，包括谷胱甘肽代谢、烟酸、烟酰胺和抗坏血酸代谢等通路。辐射后，这些差异更为显著，"葡萄糖醛酸化"和"谷胱甘肽合成和循环"成为最显著差异表达的基因集，主要在放射抵抗性类器官中上调。

图2 放射抗性类器官的谷胱甘肽代谢高于放射敏感类器官

4，筛选放射抵抗性类器官的协同药物组合： 基于上述结果，研究人员推测放射抵抗性类器官可能具有较高的氧化应激解决能力。他们测试了RRx-001，一种新型二硝基氮杂环丁烷类化合物，它可以通过与硫基形成共价加合物来耗竭细胞中的硫氧还蛋白、半胱氨酸和谷胱甘肽，从而诱导氧化应激。虽然放射抵抗性类器官具有上调的解毒代谢，但将RRx-001与辐射联合使用未能产生协同杀伤放射抵抗性类器官的效果。由于放射抵抗性类器官与放射敏感性类器官相比具有增强的谷胱甘肽代谢，研究者评估了RRx-001与谷胱甘肽或谷胱甘肽相关代谢抑制剂联合使用的效果，包括丁硫氨酯亚砜亚胺(BSO)、erastin和telaglenastat。他们还测试了其他氧化还原代谢抑制剂和涉及NADPH产生通路的抑制剂。共测试了16种药物组合对两种放射抵抗性类器官(HUB005和HUB183)的作用。研究发现，大多数RRx-001为基础的药物组合未表现出协同效应，这与最近广泛的抗癌药物组合筛选显示协同作用罕见的结果一致。然而，RRx-001与GCLC选择性抑制剂BSO的组合在HUB005和HUB183中均显示出极强的协同效应(协同评分113)。

图3 RRx-001联合筛选确定RRx-001和BSO为协同药物组合

5，单独使用BSO虽能强烈降低放射抵抗性类器官中的谷胱甘肽水平，但即使在高达100 μM的剂量下也不能有效抑制细胞存活率。单独使用RRx-001对HUB005无明显影响，而对HUB183细胞存活率降低约50%。然而，将20 μM BSO与2 μM RRx-001联合使用，在两种放射抵抗性类器官中均引起强烈的协同性细胞死亡，导致这些放射抵抗性类器官几乎完全被消除。添加N-乙酰半胱氨酸(NAC)，一种广泛用于对抗氧化应激的抗氧化剂，能有效减弱BSO和RRx-001的协同效应。此外，研究人员使用CRISPR-Ecas9技术构建的GCLC基因敲除结直肠癌来源的类器官Tor10，敲除GCLC后对低剂量RRx-001(1 μM)变得敏感，而野生型Tor10细胞即使在5 μM RRx-001处理下仍保持存活率，添加NAC能减弱RRx-001对GCLC敲除类器官的杀伤作用。

图4 GCLC抑制与RRx-001联合使用时可诱导协同细胞杀伤

全文总结

本研究采取了理性设计的方法，为放射抵抗性直肠癌寻找替代治疗选择。研究发现放射抵抗性类器官具有优越的转录适应性，并表达较高水平的DNA修复和抗氧化代谢通路。基于这些特性，研究者明确了RRx-001与GCLC抑制剂BSO的协同组合，可有效杀伤放射抵抗性类器官。虽然体外BSO单药治疗产生的临床肿瘤反应有限，且其半衰期较短(仅2小时)，无法有效降低癌症患者肿瘤内谷胱甘肽水平，但开发更有效的GCLC抑制剂，与RRx-001联合使用，可能对包括放射抵抗性直肠癌在内的各种侵袭性结直肠癌亚型的治疗产生重大影响。需要指出的是，本研究尚有一些局限性，如药物组合仅在体外测试，未来研究应评估其在体内的有效性;此外，虽然药物组合是基于放射抵抗性和放射敏感性类器官之间的转录差异理性设计的，但尚未评估这些差异是否确实与放射治疗反应或药物组合反应相关。未来研究应当彻底调查哪些肿瘤特征可预测对联合治疗的反应。