印度 Abscondita 萤火虫荧光素酶有新发现！不随 pH 红移打破萤科认知

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Characterization of luciferase from an Indian firefly Abscondita sp. (Coleoptera: Lampiridae)

中文标题：印度 Abscondita 属萤火虫(鞘翅目：萤科)荧光素酶的表征

发表期刊：《Photochemistry and Photobiology》

影响因子：2.5

作者单位：

1. Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science & Technology (AIST), Ikeda, Japan

2. Bioproduction Research Institute, AIST, Sapporo, Japan

3. Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology (IIT), Guwahati, India

4. AIST-India DAILAB, National Institute of Advanced Industrial Science & Technology (AIST), Tsukuba, Japan

5. Department of Biomedical Engineering, Osaka Institute of Technology, Asahi-ku, Japan

作者信息：

Yasuo Mitani, Shusei Kanie, Sosmitha Girisa, Ajaikumar B. Kunnumakkara, Sunil C. Kaul, Yoshihiro Ohmiya

研究背景

萤火虫荧光素酶因 pH 敏感性(酸性条件下发光色红移)被广泛用于细胞内 pH 传感器，且该特性被认为是萤科(Lampyridae)特有，叩甲科(Elateridae)、光萤科(Phengodidae)无此特征。此前研究集中在北美、欧亚等地区的萤火虫，而南亚印度分布的 Abscondita 属萤火虫，其荧光素酶的酶学特征(如 pH 敏感性、最适温度等)尚未通过重组蛋白系统表征。本研究采集印度 Guwahati 地区的萤火虫，通过 RNA 测序获取荧光素酶基因，结合原核表达与酶学分析，明确其分类归属及酶学特性，填补印度萤火虫荧光素酶研究空白，为探究萤科荧光素酶 pH 敏感性的分子机制提供新数据。

研究方法

样本采集与分子分析：2019 年 3 月在印度 IIT Guwahati 校园采集 1 对萤火虫(1 雄 1 雌)，提取雄性成虫 RNA(RNeasy 试剂盒)，进行 RNA-Seq;组装细胞色素氧化酶 I(COI)和荧光素酶基因，提交至 DDBJ/GenBank(编号 LC830864、LC830865)，基于 COI 和荧光素酶基因构建分子系统发育树。

重组荧光素酶表达与纯化：优化荧光素酶基因的大肠杆菌密码子，克隆至 pColdI 载体;大肠杆菌表达重组蛋白后，用 Ni-NTA 亲和柱纯化，PD-10 柱脱盐，SDS-PAGE 验证(约 63 kDa 单一条带)。

酶学表征：用发光仪(ATTO Phelios-2350)测酶活性，分光光度计(ATTO AB-1850S)测发射光谱;分析最适温度(20-37℃)、最适 pH(6.0-8.0)、热稳定性(25℃/37℃孵育 0-4h)，计算 D - 荧光素和 ATP 的米氏常数(Km);以商业 Photinus pyralis 荧光素酶为对照，验证 pH 敏感性差异。

实验结果

图1：印度萤火虫形态特征

图 1A(背部视图)和 1B(腹部视图)显示，左为雌虫(体长约 9mm)、右为雄虫(体长约 7mm)，两者鞘翅末端均为黑色;雄虫发光器位于第 6-7 腹节，雌虫位于第 7 腹节，符合 Abscondita 属形态特征。

图2：印度萤火虫属新定名及亲缘分析

基于 COI 基因的系统发育分析以 Pyrocoelia pygidialis 为外群，该印度萤火虫的 COI 序列与 Abscondita 属物种(A. chinensis、A. terminalis、A. anceyi)聚类，同源性达 96.47%-96.68%，证实其与 Abscondita 属亲缘关系最近，暂命名为 Abscondita sp。

图3：萤火虫荧光素酶分析支持Abscondita属归属

基于荧光素酶基因的系统发育分析以黑腹果蝇为外群，该萤火虫荧光素酶与 A. terminalis 荧光素酶聚为一支(同源性 82.39%)，且明确属于萤科分支，与叩甲科、光萤科分支区分，进一步支持其 Abscondita 属分类归属。

图4：Abscondita sp. 荧光素酶的酶学特征

图 4A 显示最适温度为 30℃，高于部分已知萤科物种;

图 4B 显示最适 pH 为 7.0，pH6.0 或 8.0 时活性仍保持约 80%;图 4C 显示热稳定性差，25℃或 37℃孵育 4h 后活性 < 20%;图 4D 显示 pH6.0 和 8.0 下，发射峰均约为 570nm，无明显红移(对照 P. pyralis 在 pH6.0 时发射峰红移至 625nm);补充实验显示其对 D - 荧光素和 ATP 的 Km 分别为 0.11mM 和 0.14mM，处于萤科荧光素酶正常范围。

研究结论

研究证实印度 Guwahati 采集的萤火虫属 Abscondita sp.(基于 COI 和荧光素酶基因系统发育分析)，其荧光素酶最适温度 30℃、pH7.0，热稳定性差但底物 Km 符合萤科范围，关键是无 pH 敏感性(pH6.0/8.0 发射峰均约 570nm，无红移)，打破 “萤科荧光素酶均具 pH 敏感性” 的认知，为工具酶开发及 pH 敏感性机制研究提供数据。