无需洗涤，一步搞定！可即用型生物发光传感器守护养猪业

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Development of a Ready-To-Use Bioluminescence Immunosensor for the One-Step Sensitive Detection of Antibodies Against African Swine Fever Virus

中文标题：可即用型生物发光免疫传感器的开发：一步法灵敏检测非洲猪瘟病毒抗体

发表期刊：《Microbial Biotechnology》

影响因子：5.2

作者单位：

1. State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, African Swine Fever Regional Laboratory of China (Lanzhou), Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, P. R. China

2. Jiangsu Co-Innovation Center for the Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease and Zoonosis, Yangzhou University, Yangzhou, P. R. China

作者信息：

Zhonghui Zhang, Xuesai Li, Qingli Niu, Jinming Wang, Yanghe Liu, Dossêh Jean Apôtre Afayibo, Wenting Chen, Songlin Yang, Hong Yin, Guiquan Guan, Jifei Yang

研究背景

非洲猪瘟(ASF)是毁灭性猪传染病，目前无有效疫苗，快速准确诊断是防控关键。现有血清学检测方法存在局限：ELISA 步骤繁琐、耗时(需数小时)，依赖专业设备; lateral flow 免疫分析(LFIA)虽便捷但灵敏度 / 特异性不足。分裂型纳米荧光素酶(split-NanoLuc)系统因灵敏度高、背景低，已用于病原体检测，但尚未用于 ASF 抗体检测。本研究开发基于 split-NanoLuc 的 “可即用型” 生物发光免疫传感器，通过 ASFV p30 蛋白(SmBiT 融合，特异性结合 Fab 区)和蛋白 G C2 结构域(LgBiT 融合，结合 Fc 区)双探针，同步结合 ASF 抗体形成三元复合物，促使 NanoLuc 重构发光，实现一步法快速检测。

研究方法

试剂与血清：获取 ASFV 阳性 / 阴性血清及其他猪病原体(CSFV、PRRSV 等)阳性血清，购买 NanoLuc 底物、His 标签抗体等试剂。

载体构建与蛋白表达：构建 SmBiT-p30(特异性探针)和 LgBiT - 蛋白 G C2(通用探针)融合基因，克隆至 pET30a 载体;大肠杆菌表达融合蛋白，His 标签纯化，SDS-PAGE 和 Western blot 验证纯度与活性。

传感器筛选：测试 4 种探针组合(LN-C2+SN-p30、LN-C2+SC-p30 等)，选择信号噪声比(S/N)最高的组合。

检测条件优化：通过棋盘滴定确定探针最优剂量(LN-C2 50ng、SN-p30 6.25ng)，优化血清稀释量(1μL，1:100 稀释)和孵育时间(10min);测试 191 份阴性血清确定 cutoff 值(x+3SD=3.7113)。

特异性与灵敏度验证：检测其他病原体血清验证特异性，二倍稀释 ASFV 阳性血清对比本方法与商用 ELISA 的灵敏度。

临床验证：用 309 份临床血清同步检测，对比本方法与商用 ELISA 的一致性。

实验结果

图1：免疫传感器设计示意图

图 1 展示传感器工作原理：SmBiT-p30 探针结合 ASFV 抗体的 Fab 区，LgBiT - 蛋白 G C2 探针结合 Fc 区;双探针与抗体形成三元复合物，促使 SmBiT/LgBiT 重构为功能性 NanoLuc，催化底物 furimazine 产生发光信号;整个过程无需洗涤，仅需一步孵育，流程简化。

图2：探针组合筛选

测试 4 种探针组合(LN-C2+SN-p30、LN-C2+SC-p30、LC-C2+SN-p30、LC-C2+SC-p30)，所有组合均能区分 ASFV 阳性 / 阴性血清，但 LN-C2(N 端融合 LgBiT 的 C2)与 SN-p30(N 端融合 SmBiT 的 p30)组合的 S/N 比最高(约 30)，选为最优探针对(图 2)，原因是 N 端融合更利于 NanoLuc 重构。

图3：探针最优剂量确定

通过棋盘滴定测试不同剂量 LN-C2(100-6.25ng)和 SN-p30(50-1.5625ng)，发现 50ng LN-C2 与 6.25ng SN-p30 组合的发光信号最强、背景最低，S/N 比最高(图 3)，确定为最优剂量。

图4：反应条件优化

图 4a(血清量优化)：测试 0.5-20μL 血清，1μL 血清(1:100 稀释)的 S/N 比最高，过高血清因内源性 IgG 竞争结合探针导致 “钩状效应”，信号下降。

图5：特异性与灵敏度分析

图 5a(特异性)：检测 CSFV、PRRSV、PCV2 等 7 种病原体阳性血清，S/N 比均 < 3.7113(cutoff 值)，仅 ASFV 阳性血清 S/N 比显著高于 cutoff，无交叉反应，特异性优异。

图 5b(灵敏度)：二倍稀释 ASFV 阳性血清，本方法检测限达 1:2048，而商用 ELISA 仅为 1:256，灵敏度提升 8 倍;原因是 NanoLuc 重构发光信号强、背景低。

研究结论

本研究开发的 split-NanoLuc 生物发光免疫传感器具有显著优势：① 一步法操作，无需洗涤，仅需 10min 完成检测;② 高特异性(无交叉反应)、高灵敏度(比 ELISA 高 8 倍);③ 临床一致性达 98.71%，适合现场检测(POCT);④ 通用性强，更换特异性探针(如替换 p30 为其他病原体抗原)可推广至其他动植物病原体抗体检测。该传感器为 ASF 防控提供快速诊断工具，也为其他传染病血清学检测提供新范式。