肠道玫瑰花肠素在砷暴露过程中保护肠道屏障完整性和微环境稳态的新作用

基本信息

英文标题：Novel Role of Gut-Derived Roseburia Intestinalis in Safeguarding Intestinal Barrier Integrity and Microenvironment Homeostasis During Arsenic Exposure

中文标题：肠道玫瑰花肠素在砷暴露过程中保护肠道屏障完整性和微环境稳态的新作用

发表期刊：《Advanced Science》

影响因子：14.1

作者单位：重庆医科大学公共卫生学院、环境与人类健康研究中心等

作者信息：Lixiao Zhou, Chunsong Wang, Jieying Gao, Xu Wu, Jingfu Qiu,*Shangcheng Xu,* Zhen Zou,* and Chengzhi Chen*等

研究背景

砷是一种广泛存在于自然环境中的类金属，通过污染饮用水导致人类肠道功能紊乱。尽管已知砷会引起肠道损伤，但其具体机制尚不明确，且缺乏有效的干预手段。肠道菌群在维持肠道稳态中发挥关键作用，但其在砷毒性中的具体功能菌种及机制仍有待阐明。

研究创新点：

首次揭示Roseburia intestinalis在砷暴露下对肠道屏障具有显著保护作用;

通过粪便微生物移植验证健康菌群可缓解砷引起的肠道损伤;

结合非靶向代谢组学与转录组学，系统阐明其保护机制;

在Caco-2和HT-29细胞模型中验证Roseburia intestinalis培养上清液的保护作用;

发现关键基因Igfbp5、Krt5、Mt2参与其保护机制。

研究方法

动物模型构建

C57BL/6J小鼠通过饮用水暴露砷(50/100 mg/L)2周，模拟急性砷中毒。

肠道屏障功能评估

H&E、AB-PAS、TBO染色评估形态、杯状细胞、肥大细胞等;

qPCR、Western blot检测紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin)及炎症因子。

粪菌移植

健康小鼠粪便菌群移植至砷暴露小鼠，评估其对肠道屏障的修复作用。

菌株筛选与验证

16S rRNA测序结合厌氧培养，筛选出Roseburia intestinalis并进行干预实验。

多组学分析

非靶向代谢组学分析血清代谢物;

转录组学分析肠道组织基因表达。

细胞实验验证

Caco-2与HT-29细胞系中验证Roseburia intestinalis上清液的保护作用;

siRNA敲低Mt2基因，验证其在抗氧化与抗凋亡中的作用。

实验结果

图1：砷破坏小鼠肠道机械屏障

(A) 肠道组织苏木精-伊红(H&E)染色代表性图像。比例尺：上方100 μm，下方50 μm。

(B-D) 肠道组织总病理评分、平滑肌厚度及黏膜深度(n = 3)。

(E) 肠道组织阿利新蓝-过碘酸希夫(AB-PAS)染色代表性图像。比例尺：上方100 μm，下方50 μm。

(F) 肠道组织杯状细胞数量(n = 3)。

(G，H) 小鼠肠道中Tjp-1和闭合蛋白的mRNA表达量(n = 3)。I-K)小鼠肠道ZO-1和闭合蛋白的蛋白质印迹图及统计分析(n = 2)。数据以均值±标准差表示(B-D，F-H，J-K)。*p < 0.05，**p < 0.01。

图2：砷元素对小鼠肠道免疫屏障和化学屏障的影响

(A) 肠道组织甲苯胺蓝O(TBO)染色代表性图像。比例尺：顶部100 μm，底部50 μm。

B)肠道组织肥大细胞数量(n = 3)。

(C-G) 小鼠肠道中白细胞介素-1𝛽、肿瘤坏死因子𝛼、白细胞介素-6、白细胞介素-10及T-bet的mRNA表达水平(n = 3)。

(H-I) 小鼠肠道中HO-1蛋白的免疫印迹图像及统计分析(n = 2)。

(I-L) 小鼠肠道乳糖酶、麦芽糖酶和蔗糖酶活性检测(n = 5)。M)帕内特分泌蛋白溶菌酶的免疫组化染色肠组织图像。比例尺：顶部100 μm，底部50 μm。N)小鼠肠道溶菌酶积分密度分析(n = 3)。数据以均值±标准差表示(B-G，I-L，N)。*p < 0.05，**p < 0.01，n.s.，无显著性差异。

图3：砷对小鼠肠道生物屏障的影响

(A-C) 通过Sobs、Chao和Ace指数评估的肠道微生物群α多样性(n = 12)。

(D) 属水平维恩图。

(E，F) 属水平肠道微生物群主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图。

(G) 属水平肠道微生物群平均相对丰度。

(H) 砷诱导的前七种微生物变化对比气泡图。

(I) 砷诱导对肠道生物、化学、机械和免疫屏障不良影响的示意图。数据以均值±标准差表示(A-C)。*p < 0.05。

图4：肠道微生物移植(FMT)可缓解砷对小鼠肠道机械屏障的不良影响

(A) FMT实验设计示意图。

(B) 肠道组织苏木精-伊红(H&E)染色代表性图像。比例尺分别为100μm(上图)和50μm(下图)。

(C-E) 肠道组织平滑肌厚度、黏膜深度及总病理评分(n = 3)。

(F) 肠道组织阿利新蓝-过碘酸希夫(AB-PAS)染色代表性图像。比例尺分别为100μm(上图)和50μm(下图)。

(G) 肠道组织杯状细胞数量(n = 3)。

(H，I) 小鼠肠道Tjp-1和闭合蛋白mRNA表达水平(n = 3)。J-L)小鼠肠道ZO-1和闭合蛋白的蛋白质印迹图像及统计分析(n = 2)。数据以均值±标准差表示(C-E、J-I、K，L)。*p < 0.05，**p < 0.01。

图5：肠道微生物移植(FMT)可缓解砷对小鼠肠道免疫屏障和化学屏障的损害作用

(A-C) 小鼠肠道乳糖酶、麦芽糖酶和蔗糖酶活性检测(n = 5)。

(D) 潘氏分泌蛋白溶菌酶免疫组化染色显示的肠道组织代表性图像。比例尺：顶部100 μm，底部50 μm。

(E) 小鼠肠道溶菌酶整合选项密度检测(n = 3)。

(F-I) 小鼠肠道Il-1𝛽、Tnf-𝛼、Il-6和T-bet mRNA表达水平检测(n = 3)。

(J) 腹染蓝O(TBO)染色的肠道组织代表性图像。比例尺：顶部100 μm，底部50 μm。

(K) 肠道肥大细胞数量检测(n = 3)。

(L，M) 小鼠肠道HO-1蛋白的蛋白质印迹图及统计分析(n = 2)。N)小鼠肠道Il-10 mRNA表达水平检测(n = 3)。数据以均值±标准差表示(A-C，E-I，K，M，N)。*p < 0.05，**p < 0.01，n.s.，无显著差异。

图6：莲子有效缓解了砷对小鼠肠道机械屏障的不良影响

(A) 莲子培养与验证示意图。

(B) 莲子给药实验设计示意图。

(C) 肠道组织苏木精-伊红(H&E)染色代表性图像(上：100 μm;下：50μm)。

(D-F) 肠道组织总病理评分、平滑肌厚度及黏膜深度(n = 3)。

(G)肠道组织阿利新蓝-过碘酸希夫(AB-PAS)染色代表性图像(上：100 μm;下：50μm)。H)肠道组织杯状细胞数量(n = 3)。

(I) 小鼠小肠Muc2表达免疫荧光检测代表性图像(n=3，比例尺：50μm)。J，(K) 小鼠肠道Tjp-1与闭合蛋白mRNA表达水平(n = 3)。L-N)小鼠肠道ZO-1与闭合蛋白蛋白质印迹检测及统计分析(n = 2)。数据以均值±标准差表示(D-F，H，J，K，M，N)。*p < 0.05，**p < 0.01。

图7：肉豆蔻有效缓解了砷对小鼠肠道免疫屏障和化学屏障的不良影响

(A、B) 小鼠肠道乳糖酶和麦芽糖酶活性检测(n = 5)。

(C) 胰腺分泌蛋白溶菌酶免疫组化染色显示的肠道组织代表性图像。比例尺：顶部100 μm，底部50 μm。

(D) 小鼠肠道溶菌酶整合选项密度检测(n = 3)。

(E) 小鼠肠道蔗糖酶活性检测(n = 5)。

(F-I) 小鼠肠道Il-1𝛽、Tnf-𝛼、Il-6和T-bet mRNA表达水平检测(n = 3)。

(J，K) 小鼠肠道HO-1蛋白的代表性western blot图像及统计分析(n = 2)。

(L) 肠道组织甲苯胺蓝O(TBO)染色图像。比例尺：顶部100 μm，底部50 μm。M)肠道组织肥大细胞数量检测(n = 3)。

(N) 肠道来源肉豆蔻对砷诱导肠道损伤的保护作用示意图。数据以均值±标准差表示(A，B，D–I，K，M)。*p < 0.05，**p < 0.01，n.s.，无显著性差异。

图8：肉豆蔻对砷污染血清代谢物的影响

(A) 小鼠血清代谢组学数据火山图。

(B) 小鼠血清代谢谱偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图。

(C) 前20个差异表达代谢物热图。

(D) 差异表达代谢物京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。

(E) 砷污染影响的关键代谢通路。

(F-H) 肉豆蔻含量与主要差异表达代谢物的斯皮尔曼相关性分析。n = 10。

图9：罗勒菌(Roseburia intestinalis)引发砷污染导致的肠道基因表达变化

(A) 小鼠肠道组织中差异表达基因的热图分析。

(B) Kyoto基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析结果。

(C-E) 通过RT-qPCR检测小鼠肠道中Igfbp5、Krt5和Mt2的mRNA表达水平(n = 3)。数据以均值±标准差表示，*p<0.05，**p < 0.01。

图10：芦苇属植物培养上清液缓解砷对Caco-2和HT-29肠道细胞系的毒性作用

(A、B) 砷处理后Caco-2和HT-29细胞在使用或未使用芦苇属植物培养上清液干预后的存活率(n = 6)。

(C-F) 通过Annexin V-PI染色进行的细胞凋亡流式分析结果，以及砷处理后Caco-2和HT-29细胞使用或未使用芦苇属植物培养上清液干预后的凋亡情况(n = 3)。

(G-J) DCFH-DA染色显示的细胞内活性氧(ROS)流式分析结果，以及砷处理后Caco-2和HT-29细胞使用或未使用芦苇属植物培养上清液干预后的ROS水平(n = 3)。

(K-N) 砷处理后Caco-2和HT-29细胞使用或未使用芦苇属植物培养上清液干预后的HO-1蛋白条带图像及定量分析结果(n = 3)。

(O、P) 砷处理后Caco-2细胞在使用或未使用芦苇属植物培养上清液干预时的细胞凋亡和细胞内ROS定量分析结果，是否使用Mt2基因敲低(n = 3)。数据以均值±标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01。

研究结论

砷暴露导致肠道绒毛断裂、杯状细胞减少、紧密连接蛋白表达下降、炎症因子上升、菌群多样性降低;FMT显著改善上述损伤;Roseburia intestinalis 干预可恢复肠道屏障结构、降低炎症、提升酶活性;代谢组发现cacodylic acid、3-hydroxymelatonin等代谢物与砷毒性相关;转录组揭示Igfbp5、Krt5、Mt2等基因在保护机制中起关键作用;细胞实验证实其通过Mt2介导的抗氧化与抗凋亡途径发挥作用。

研究结论

本研究首次揭示Roseburia intestinalis在砷暴露中对肠道屏障具有显著保护作用，其机制涉及代谢物调控、免疫通路调节、抗氧化与抗凋亡等多方面。该研究为从肠道菌群角度防治砷相关肠道疾病提供了新策略和实验依据。