打破“开关”认知！NTCP的G102位点竟是“功能变阻器”，影响胆汁酸转运与细胞表达

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Amino acid substitutions at rheostat positions in the (Na^{+})/taurocholate cotransporting polypeptide substrate channel have pleiotropic effects

中文标题：Na⁺/牛磺胆酸共转运多肽底物通道中变阻器位点的氨基酸替换具有多效性效应

发表期刊：《Protein Science》

影响因子：5.2

作者单位：

1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas, USA

2. Department of Pharmacology, Toxicology, and Therapeutics, The University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas, USA

作者信息：

Liskin Swint-Kruse, Melissa J. Ruggiero, Bruno Hagenbuch

研究背景

Na⁺/牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)是肝细胞基底膜上负责胆汁酸肠肝循环的关键转运蛋白，也是乙肝病毒(HBV)的细胞受体，其基因(SLC10A1)的大量错义SNP(>580个)中，多数为“意义不明变异”(VUS)。现有计算工具难以预测“变阻器位点”(rheostat positions)的变异效应——这类位点的氨基酸替换会导致功能(如转运活性)呈现“增益-中性-部分/完全失活”的连续变化，而非简单“开关效应”。此前研究发现NTCP的S267、N271为变阻器位点，但更多位点的特性未知。本研究选取两个“非预期变阻器位点”：高度保守且深埋于底物通道的G102(预期为“开关位点”，替换即失活)、非保守且溶剂暴露的Y146(预期为“中性位点”，替换无影响)，通过全替换突变(19种氨基酸)分析其对底物转运和细胞表面表达的影响，揭示NTCP底物通道中变阻器位点的普遍性及多效性，为SNP功能预测提供新依据。

研究方法

NTCP突变体构建与细胞转染：优化NTCP基因的大肠杆菌密码子，构建G102和Y146的19种氨基酸替换突变体(G102X/Y146X)，克隆至pColdI载体;瞬时转染HEK293T/17细胞，48h后进行功能检测。

底物转运活性检测：用放射性标记底物([³H]-牛磺胆酸TCA、[³H]-雌酮-3-硫酸盐E3S、[³H]-瑞舒伐他汀)，37℃孵育5min后终止反应，液闪计数测放射性，计算净摄取量(扣除空载体组)，以野生型(WT)活性为100%量化突变体活性。

细胞表面表达检测：采用表面生物素化实验，结合Western blot(抗His标签抗体检测NTCP，抗Na⁺/K⁺-ATP酶为内参)，Image Studio Lite定量表面表达量，以WT为100%评估突变体表达水平。

变阻器评分与生物信息学分析：用RheoScale工具计算变阻器评分(0-1，≥0.5为变阻器位点);通过ConSurf分析位点保守性(1=最不保守，9=最保守)，构建基于COI基因的系统发育树。

实验结果

图1：NTCP结构与目标位点定位

图1展示NTCP内向开放(PDB 7fci)和外向开放(PDB 7zyi)的冷冻电镜结构，目标位点G102(品红色)深埋于底物通道内部，Y146(绿色)位于通道开口处的溶剂暴露环;S267(粉色，已知变阻器位点)、N271(青色，中度变阻器位点)作为对照，底物(黑色)和Na⁺(紫色球体)的结合位点清晰可见，ConSurf评分显示G102保守性高(评分4)，Y146保守性低(评分8)。

图2：G102X/Y146X的底物摄取活性

左图(G102X)显示：G102为TCA转运的变阻器位点(活性呈连续梯度)，但多数替换显著降低E3S和瑞舒伐他汀摄取;WT(G102)对三种底物的转运活性最优，仅G102A的TCA摄取接近WT。

右图(Y146X)显示：多数替换对三种底物摄取无显著影响，但Y146S和Y146N完全无转运活性，其余替换活性与WT差异<20%。

图3-4：G102X/Y146X的细胞表面表达

图3(G102X)显示：G102I/L/K/R/V无表面表达(解释其无转运活性)，其余替换表达量呈梯度变化(如G102A达WT的150%，G102F仅为WT的50%)，证实G102是表达的变阻器位点。

图4(Y146X)显示：Y146S/Y146N无表面表达(解释其无转运活性)，其余替换表达量与WT差异<30%，证实Y146为近中性位点。

图5：校正表面表达后的转运活性

用表面表达量校正转运活性后，G102X中部分低表达突变体(如G102D)的实际转运效率接近WT，而G102F等仍显著降低;Y146X校正后活性与未校正时无显著差异，进一步证实Y146替换对转运机制无直接影响。

图6：G102X的底物特异性

pairwise分析显示，G102X对三种底物的校正转运活性呈显著正相关(Spearman r=0.67-0.85)，说明G102替换不改变底物特异性，与S267(可改变底物特异性)形成对比。

图7：各位点的变阻器评分

直方图显示：G102的表面表达和三种底物转运的变阻器评分均≥0.5(典型变阻器位点);Y146评分≤0.22(近中性位点);S267(评分0.52-0.78)为强变阻器位点，N271(评分0.43)为中度变阻器位点;所有位点均存在“超WT活性”的替换，证实进化未筛选出“最优”序列。

图8：保守性与变阻器特性的关联

左图显示，位点的变阻器评分总和与ConSurf保守性评分呈正相关(Pearson r=0.97，p=0.03)：G102(保守性4)评分最高，Y146(保守性8)最低;右图显示，平均活性无法区分位点特性，而变阻器评分可清晰归类，证实保守性是变阻器位点的重要指标。

图9：AlphaMissense预测的局限性

AlphaMissense对G102X/Y146X的功能预测与实验结果相关性差：多数“预测良性”的突变体实际活性降低，且无法预测底物特异性变化(如S267F对TCA和瑞舒伐他汀的转运差异)，证实现有计算工具未考虑变阻器位点的多效性。

研究结论

本研究给 Na⁺/ 牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)的 “功能调控密码” 来了次大揭秘!深躲在底物通道里、本该是 “一碰就坏” 的保守位点 G102，居然是个灵活的 “双功能变阻器”——19 种氨基酸替换让它在细胞表面表达和底物转运上玩起了 “梯度调节”，只有野生型的甘氨酸能完美平衡这两项任务，还不打乱底物特异性;而暴露在溶剂里、看似 “佛系百搭” 的 Y146 也藏着惊喜，多数替换都 “岁月静好”，唯独 Y146S 和 Y146N 直接 “罢工”(一个没糖基化、一个被降解)。更有意思的是，加上之前发现的 S267、N271，NTCP 的底物通道里简直藏了一串 “调节旋钮”，每个变阻器位点都有自己的 “脾气”(比如 G102 管表达 + 转运，S267 管底物偏好)。可惜现有的 AlphaMissense 这类预测工具，根本摸不透这些 “旋钮” 的多效性，看来以后解读 NTCP 的意义不明变异(VUS)，得先搞懂这些变阻器位点的 “小性子” 才行!