利用双网络水凝胶促进编织骨类器官形成和增强骨再生

骨类器官是一种体外三维模型，通过干细胞培养实现自组织、分化、细胞外基质分泌和生物矿化，最终形成矿化胶原层级结构，从而模拟天然骨组织的结构和功能。然而，骨类器官的发展常常受到缺乏适合基质材料的限制，这些材料需要具有支持细胞持续生长和分化的最佳力学性能。目前用于骨类器官构建的支架材料，如脱矿细胞外基质和丝蛋白支架，虽然为研究骨重塑和成骨提供了有用平台，但往往无法完全复制三维细胞培养系统。3D打印和微流控技术虽然解决了3D培养中营养物质扩散的挑战，但人工设计可能直接影响细胞行为，潜在地破坏了类器官的自组织和延迟骨整合与重塑。因此，需要开发一种能准确复制体内骨微环境并支持自主3D细胞培养的批量基质材料。水凝胶材料的力学性能，特别是粘弹性，在调节干细胞命运和自组织过程中起着关键作用，这对于类器官发展至关重要。亲水甲基丙烯酸明胶(GelMA)水凝胶由于其与细胞外基质的组成相似性已被广泛用于骨组织再生，但常规的GelMA和其他化学交联水凝胶通常缺乏骨类器官发展所需的粘弹性。

近期，上海大学苏佳灿、井莹莹和上海交通大学附属新华医院王建华、王光超等在Advanced Materials期刊上发表了题为Dynamic GelMA/DNA Dual-Network Hydrogels Promote Woven Bone Organoid Formation and Enhance Bone Regeneration的研究论文，该研究开发的动态CGDE水凝胶提供了一个稳健且可扩展的平台，用于骨类器官发展和骨组织再生。这种创新的双网络水凝胶通过模拟骨组织的关键生化和力学特性，克服了传统支架材料在支持持续细胞生长和分化方面的局限性。CGDE水凝胶中DNA和GelMA之间的非共价相互作用提供了理想的粘弹性环境，促进了细胞迁移、自组织和网络形成，这对于类器官发展至关重要。同时，EACP纳米矿物质的引入和CAT的接枝有效地诱导了BMSCs的成骨分化并调节了培养微环境，进一步增强了类器官的发展。

图示描述

1，研究者开发了一种动态DNA/GelMA双网络水凝胶(CGDE)，通过DNA和GelMA之间的氢键以及GelMA网络交联相结合，实现了适当的机械强度和增强的粘弹性。研究团队首先通过交联分析、流变学测试和理论模拟，证实了DNA和GelMA之间存在非共价相互作用(主要是氢键)。这种双网络结构使CGDE水凝胶具有良好的自愈合特性，存储模量(G')和损耗模量(G")的适当比例，以及优异的应力松弛特性，从而为细胞生长、迁移和分化提供了理想的微环境。

2，CGDE水凝胶中还整合了酶制备的无定形磷酸钙(EACP)纳米矿物质，模拟线粒体矿物生物合成，刺激骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化。同时，为减轻3D培养中过量的活性氧(ROS)，通过AC-PEG-NHS链接剂将过氧化氢酶(CAT)接枝到GelMA上，赋予水凝胶清除ROS的能力。这些设计使CGDE水凝胶展现出优异的生物相容性、促成骨活性、抗炎和促血管生成能力。二维细胞培养实验表明，CGDE水凝胶提取物显著促进BMSCs中成骨相关基因表达，如ALP、OSX、RUNX2、COL-1和OCN，并增强碱性磷酸酶活性和矿化。

图 1 动态 CGDE 水凝胶的设计以及在 CGDE 基质中编织骨类器官(WBOs)的发育用于骨组织再生的示意图

3，在三维细胞培养中，CGDE水凝胶作为骨类器官基质的评估显示，其21天培养(CGDE-21C)的BMSCs重塑了水凝胶基质，经历了增殖、自组织和成骨分化，形成了一种基于结构表征和细胞成分存在而被鉴定为编织骨类器官(WBO)的细胞-基质构建体。与其他实验组相比，CGDE-21C展示了最高的细胞活力、最佳的细胞骨架延伸和更高的矿化含量。组织学分析和免疫染色证实CGDE-21C中存在典型的编织骨结构，包含前成骨细胞、成骨细胞和早期成骨细胞标志物。

4，研究团队进一步追踪了WBO在CGDE水凝胶中的顺序发展，发现其经历了不同的发展阶段：细胞增殖(7天)、自组织(14天)、自矿化(21天)和最终的基质崩溃阶段(30天)。第21天的WBO展示了最佳的机械强度、细胞活性和结构完整性，代表了体外编织骨发展的最佳时期。异位成骨活性评估显示，CGDE-21C组在皮下植入4周后形成了明显的矿化组织，具有完善的血管网络和最高的骨体积分数(BV/TV)和骨矿物密度(BMD)。

5，转录组测序分析揭示，CGDE水凝胶通过下调先天免疫反应和增强细胞自组织来支持WBO发展，可能通过激活MAPK信号通路。成熟的WBO(CGDE-21C)显著上调了与胶原纤维组织和骨化相关的基因，并下调了适应性免疫反应，这可能增强了它们与宿主骨组织的整合能力。此外，在大鼠颅骨缺损修复模型中，CGDE-21C组在4周内即覆盖了约50%的缺损区域，12周后WBO逐渐与宿主骨组织整合并重塑为更有序的板层骨。

图 2 GelMA/DNA 水凝胶的表征

全文总结

该研究中开发的WBO系统部分重现了骨组织发育的自然过程，特别是膜内成骨过程，为研究骨生物学和骨发育机制提供了宝贵的体外模型。这种类器官系统不仅展示了随时间演变的空间架构，支持动态矿化和组织重塑，而且在体内表现出自适应性，能够快速与宿主骨缺损部位整合。这种特性使WBO成为潜在的骨组织工程和再生医学应用的理想候选材料。总体而言，这项工作为骨类器官的发展提供了新的策略和见解，为骨组织工程和再生医学领域开辟了新的可能性。通过创建一个能够支持细胞自组织和功能分化的生物模拟微环境，本研究为未来开发更复杂的骨类器官系统和治疗骨缺损的新方法奠定了基础。