基于猪逆转录病毒逆转录酶的高效哺乳动物基因组编辑

基本信息

英文标题：Highly efficient prime editors for mammalian genome editing based on porcine retrovirus reverse transcriptase

中文标题：基于猪源逆转录酶的高效哺乳动物基因编辑引物编辑系统

发表期刊：《Trends in Biotechnology》

影响因子：14.9

作者单位：江西农业大学猪遗传改良与种质创新全国重点实验室等

作者信息：刘为伟、黄路生、段文鑫、彭志伟、幸宇云等

研究背景

引物编辑是一种无需双链断裂或外源DNA模板即可实现精准基因编辑的技术。目前大多数引物编辑器使用鼠源逆转录酶，效率仍有提升空间。猪内源性逆转录病毒与鼠源病毒亲缘相近，其逆转录酶具有天然多样性，有望成为更高效的编辑工具。

研究创新点：

首次从巴马小型猪中筛选出高效猪源逆转录酶，构建 pvPE 系统;

通过多重工程化改造(点突变、结构优化、La蛋白融合)逐步升级至 pvPE-V4，编辑效率提升 24.38–101.69 倍;

发现小分子 Nocodazole 可通过抑制错配修复通路显著提升编辑效率;

结合体细胞核移植技术，成功构建 三基因编辑阿尔茨海默病猪模型，模拟人类AD病理特征。

研究方法

PERV-RT筛选与系统构建

从多个猪种中扩增并筛选86种PERV-RT变体，构建pvPE系统;

工程化优化

引入点突变(如Y63R、C408R)、删除RNase H结构域、融合NC蛋白与La蛋白;

小分子增强

测试7种小分子，发现Nocodazole可显著提升编辑效率;

多基因编辑与动物模型构建

在猪胎儿成纤维细胞中同时编辑 APP、PSEN1、TAU 基因，结合SCNT技术获得克隆猪;

安全性评估

通过GUIDE-seq与测序验证脱靶效应，显示pvPE系统安全性良好。

实验结果

图1：基于天然猪内源性逆转录病毒fi(PERV)-逆转录酶的多肽可编程元件(pvPEs)编辑效率评估

(A) PE1与pvPE系统的结构示意图。

(B) 三种荧光报告系统示意图。BFP转GFP：通过将第66位氨基酸组氨酸替换为酪氨酸(核苷酸CAC变为TAC)，可将BFP转化为GFP。GFP10(–)：GFP编码区存在10个碱基对缺失;插入缺失的10bp序列后，可恢复GFP表达。GFP10(+)：GFP编码区存在10bp插入;删除10个碱基对序列后，GFP表达可恢复。

(C) 本研究中使用的PERV逆转录酶系统进行的系统发育分析。不同PERV逆转录酶名称以猪品种、PERV亚型及数字索引形式标注。

(D) 24种pvPE、PE1和PE2在HEK293T细胞中三种荧光报告系统的编辑效率对比。

(D) PE1、pvPE-293-isolated_A/C、pvPE-V1和PE2在HEK293T细胞内源位点的编辑效率。

(F) 四种选定编辑器的编辑效率倍数变化汇总。数值基于(E)数据计算得出，各靶向位点使用PE1的效率均以1为基准进行标准化。数据以均值±标准差表示，包含三个独立生物学重复，采用双尾学生t检验分析：ns表示p >0.05;***表示p<0.001。

缩写说明：CMV为巨细胞病毒即早启动子;PA为多聚腺苷酸化;Uc表示未明确。

图2：通过工程化猪内源性逆转录病毒(PERV)-逆转录酶(RT)提升pvPE效率

(A) 携带与Moloney病毒株对应有益突变的pvPE-V1变体效率对比

(B) 基于鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶的PE系统在三种荧光报告系统中的应用效果。

(C) HEK293T细胞内源位点靶向的pvPEV1-M5.1变体编辑效率对比。

(D) 四种变体编辑效率变化倍数汇总(数据源自C部分，其中pvPEV1-M5.1各基因座效率均归一化为1)。

图E 展示了pvPEV1-M5.1(PERV-RT-M5.1)与pvPE-V2(PERV-RT-M7)逆转录酶结构对比：通过AlphaFold3预测的结构中，PERV-RT-M5.1和PERV-RT-M7分别用绿色和蓝色标注。为清晰展示，PERV-RT-M5.1中Y63和C408位点、PERV-RT-M7中R63和R408位点的局部结构被放大显示。数据以均值±标准差表示，基于三次独立生物学重复实验，采用双尾学生t检验分析;***P <0.001。

图3：通过优化pvPE结构提升编辑效率

(A) pvPE-V2、pvPE-V2-NC、pvPE-V2-ΔH及pvPE-V2-NCΔH(pvPE-V3)的结构示意图。

(B，C) 四种PE在荧光报告系统中的编辑效率(B)及在HEK293T细胞内源位点的编辑效率(C)。

(D) 四种PE编辑效率变化倍数的汇总数据。数值基于(C)数据计算，其中pvPE-V2对各位点的编辑效率均以1为基准进行标准化。

(E)PEmax、PE6c、PE6d及pvPE-V3在HEK293T细胞中的编辑效率对比。

(F，G) PEmax、PE6c、PE6d及pvPE-V3在(F)编辑效率变化倍数和(G)副产物数据的汇总。数值基于(E)数据计算，其中PEmax对各位点的编辑效率均以1为基准进行标准化。数据以均值±标准差表示，基于三个独立生物学重复，采用双尾学生t检验分析;ns：P >0.05;*P <0.05;***P <0.001。

缩写：CMV，巨细胞病毒即早启动子;ΔH，RNase H缺失;NC，核衣壳蛋白;PA，多聚腺苷酸化酶。

图4：小分子对pvPE系统的影响

(A) 小分子处理流程示意图。

(B) 小分子对HEK293T细胞和猪胎儿成纤维细胞(PFFs)中pvPE-V3效率的影响。

(C) 比较pvPE-V3与pvPE-V3 +诺考达唑(Noc)在PFFs、犬胎儿成纤维细胞(CFFs)、绵羊胎儿成纤维细胞(SFFs)及U2OS细胞系中的编辑效率。

(D) 诺考达唑处理PFFs转录组中差异表达基因(DEGs)的火山图分析。

(E) 诺考达唑处理PFFs转录组中DEGs的京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。数据以均值±标准差表示，包含三个独立生物学重复。

缩写：DMSO，二甲基亚砜;FC，倍数变化;MAPK，丝裂原活化蛋白激酶。

图5：通过pvPE-V3-Puro +罗丹明(Noc)系统与体细胞核移植技术构建3×转基因阿尔茨海默病(AD)模型猪

(A) 3×转基因AD猪的培育流程示意图。

(B) 靶向三个基因位点的单细胞克隆编辑效率统计分析。

(C) 单细胞克隆基因型分布维恩图。

(D) 三基因编辑克隆的桑格测序图谱。

(E) 断奶后3×转基因AD克隆猪的影像。分娩1、分娩2：首次和第二次克隆猪分娩。分娩3、4：克隆猪的第三次和第四次分娩。3/11、8/8、8/10：斜杠左右两侧的数字分别表示存活至断奶并活产的克隆仔猪数量。

(F) 对10月龄3×Tg-AD(n=3)与同龄野生型(WT)猪(n = 3)脑脊液(

脑脊液)中Aβ42、Aβ40及Aβ42/40比值的定量分析。

(G) 对10月龄3×Tg-AD(n=3)与同龄WT猪(n = 3)海马组织中总tau蛋白(TAU5)及Ser396、Thr231和Ser404位点磷酸化tau蛋白的蛋白质印迹分析。多条条带代表不同的tau亚型。

(H) 图G所示tau磷酸化的定量分析。首先将总tau和磷酸化tau的表达水平以GAPDH为内参进行标准化处理，随后通过磷酸化tau与标准化总tau的比值来量化tau磷酸化水平。

图6：通过与La蛋白融合提升pvPE效率

(A) pvPE-V2-La和pvPE-V3-La(pvPE-V4)的结构示意图。

(B，C) pvPE-V2、pvPE-V2-La、pvPE-V3及pvPE-V4在HEK293T细胞荧光报告系统(B)和内源位点HEK293T细胞(C)中的编辑效率。

(D) PE7、pvPE-V4及pvPE-V4 +诺考达唑(Noc)在HEK293T、猪胎儿成纤维细胞(PFFs)、犬胎儿成纤维细胞(CFFs)和绵羊胎儿成纤维细胞(SFFs)中的编辑效率对比。

(E，F) HEK293T、PFFs、CFFs和SFFs中PE7、pvPE-V4及pvPE-V4 + Noc的编辑效率倍数变化与副产物含量总结。数值基于(D)数据计算，各位点PE7效率均以1为基准进行标准化。数据以均值±标准差表示，包含三个独立生物学重复，采用双尾学生t检验：*P <0.05;**P <0.01;***P <0.001。

缩写：aa，氨基酸;CMV，巨细胞病毒即早启动子;ΔH，RNase H缺失;NC，核衣壳;PA，多聚腺苷酸化

研究结论

pvPE-V4 在多种哺乳动物细胞中编辑效率显著优于PE7，最高提升 2.39 倍;Nocodazole 处理使编辑效率平均提升 2.25 倍;三基因编辑猪模型中，TAU 位点编辑效率高达 92.2%，双/三基因编辑克隆占比 45%;10月龄AD模型猪脑脊液中Aβ42/Aβ40比值显著升高，海马区Tau蛋白磷酸化水平上升，初步模拟AD病理特征。

本研究成功开发了基于猪源逆转录酶的高效引物编辑系统 pvPE，通过系统优化与小分子辅助，实现了在多种哺乳动物细胞及猪模型中的高效、精准基因编辑。该系统不仅提升了编辑效率与安全性，还为阿尔茨海默病等人类疾病的大动物模型构建提供了可靠工具，具有广阔的农业与生物医学应用前景。