利用人类诱导多能干细胞工程化氧化应激报告器官样体进行毒性测试

传统的候选药物和化学物质安全性测试长期依赖体外单一细胞培养和动物体内测试的组合。然而，体外单一培养缺乏真实组织的复杂性，无法反映表现为生理、稳定性或组织结构改变的毒性效应。而动物测试则面临伦理问题，且存在实验动物与人类之间的生理差异，尤其是在转运蛋白表达方面。据估计，90%在动物测试中表现良好的药物候选物在人体试验中会因缺乏效力或出现毒性而失败。

Fletcher的一项著名研究分析了45种药物的动物和人体毒性数据，发现13种药物的动物数据与人体无相关性，17种仅部分相关。该研究推测，平均只有25%的动物毒性效应可能在人体中出现，表明许多药物候选物可能因基于动物模型外推的人体毒性假阳性而被放弃。肾脏组织尤其如此，有9%通过动物肾毒性临床前测试的候选药物在人体试验中导致药物诱导的肾损伤。这些统计数据及其对试验参与者和药物开发投资的风险，使得开发更好的基于人类的体外测试方法变得极其重要。器官样体(organoids)的发展成为这一方向的重要一步。虽然器官样体不能完全反映其代表的组织，但它们比简单的2D细胞单一培养更接近真实组织，且比获取健康的人体组织样本容易得多。

近期，发布在Methods in molecular biology期刊，题为Toxicity Testing Using Organoids Made from Human-Induced Pluripotent Stem Cells Engineered to Report Oxidative Stress的研究旨在开发一种能够报告氧化应激的人类诱导多能干细胞(hiPSC)工程化技术，以及利用这些细胞生成能够报告氧化应激的肾脏器官样体，并利用这些器官样体筛选一系列肾毒性化合物。

图示描述

1，研究团队首先工程化人类诱导多能干细胞(hiPSC)以报告氧化应激，这是细胞暴露于毒物时的常见(但非普遍)结果。他们在HMOX-1启动子(在氧化应激响应中上调)的控制下放置了一个报告基因mCherry。这些经过工程改造的hiPSC细胞在未分化状态下被验证对氧化应激物(如过氧化氢)有响应。如图1所示，在未分化的报告细胞中，随着H2O2浓度的增加(0μM、125μM和250μM)，mCherry荧光信号逐渐增强，表明该报告系统能够有效检测氧化应激反应。

图1 使用过氧化氢作为氧化应激源诱导未诱导的hiPSC中的HMOX-1报告基因

2，随后，研究人员利用这些工程化的hiPSC细胞生成了肾脏器官样体。在生成的器官样体中，研究团队使用FITC标记的莲花四角豆凝集素(LTL)验证了近端小管的存在，这是肾脏器官样体形成的重要标志。如图2所示，LTL染色清晰地标记了器官样体中的近端小管结构，可选择性地添加WT1(用于发育中的鲍曼囊)和CDH1(用于远端小管)等其他染色，进一步确认器官样体的多细胞类型组成。这表明成功生成了具有肾脏特征的器官样体。

图2 LTL染色，以验证近端小管的存在

3，利用这些能够报告氧化应激的肾脏器官样体，研究团队进行了盲法编码的化合物筛选。测试化合物包括庆大霉素、顺铂、西多福韦、地塞米松、异环磷酰胺、酮洛芬和嘌呤霉素等，浓度呈四倍系列梯度。器官样体暴露于这些化合物24小时和72小时后，测量其mCherry荧光强度。如图3所示，非肾毒性药物酮洛芬在任何测试浓度下都未引起显著荧光反应，而已知肾毒性药物异环磷酰胺则随着浓度增加引起明显且具有统计学意义的荧光信号增强，荧光强度与对照组相比增加了约50%。

图3 由HMOX-1报告高PSCs制成的肾类器官对两种药物浓度系列的反应示例

4，研究团队建立了严格的实验方案，包括在每次实验中使用已知阴性和阳性对照(250μM H2O2)，以验证器官样体的预期行为。数据分析采用ImageJ软件测量荧光强度，并使用标准统计方法(如未配对t检验)评估与对照组的差异显著性。实验采用盲法设计，确保分析人员不知道所测试的化合物身份，直到数据收集和初步分析完成，从而避免观察者偏倚。

5，研究发现，不同化合物的反应模式各异。某些化合物在24小时即可诱导显著反应，而另一些则需要72小时才能观察到效应。因此，研究团队采用"24小时或72小时"的评估原则，即如果在任一时间点观察到与对照组的显著差异(p<0.05)，则认为该物质在该浓度下是氧化应激诱导剂。这种双时间点策略能够捕捉到不同化合物的特异性反应动态。

全文总结

该研究开发了一种创新方法，利用工程化的人类诱导多能干细胞(hiPSC)生成能够实时报告氧化应激的肾脏器官样体，为药物毒性筛选提供了一个更接近人体的体外模型。这种方法弥补了传统细胞培养缺乏组织复杂性和动物模型存在种间差异的不足，有潜力提高药物开发前期安全性评估的准确性。该技术虽然是概念验证性质，尚未获得特定监管认可，但为高通量毒性筛选方法的开发奠定了基础。值得注意的是，该报告系统的原理并非肾脏特异性，而是基于HMOX-1启动子对氧化应激的普遍反应，因此可扩展应用于其他类型的器官样体研究，或利用相同原理开发针对其他细胞应激通路的报告系统。这种灵活性使该技术在多种药物和化学品安全性测试中具有广泛应用前景，有望减少不必要的动物试验和提高临床前药物筛选的效率与准确性。