覆盖 7 类生物制品！NF-κB 报告细胞系成热原检测新工具

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：A novel alternative for pyrogen detection based on a transgenic cell line

中文标题：基于转基因细胞系的新型热原检测替代方法

发表期刊：《Signal Transduction and Targeted Therapy》

影响因子：52.7

作者单位：

1. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing, China

2. School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, China

3. Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai, China

4. KeyMed Biosciences Inc., Chengdu, China

作者信息：

Qing He¹, Chuan-Fei Yu¹, Gang Wu², Kai-Qin Wang¹, Yong-Bo Ni¹, Xiao Guo¹, Zhi-Hao Fu¹, Lan Wang¹, De-Jiang Tan¹, Hua Gao¹, Can Wang³, Gang Chen³, Xu-Hong Chen⁴, Bo Chen⁴, Jun-Zhi Wang¹*

研究背景

热原(包括内毒素和非内毒素)是注射类药物(生物制品、化学药、中药及医疗器械)的关键安全隐患，传统检测方法存在显著局限：兔热原试验(RPT)体外相关性差、操作繁琐且成本高;细菌内毒素试验(BET)仅能检测革兰氏阴性菌内毒素，易受高蛋白样品干扰，且鲎试剂因鲎保护面临供应问题;单核细胞激活试验(MAT)依赖人外周血单核细胞或全血，个体差异大、标准化难，且 MM6 细胞系受专利限制。热原引发发热的核心机制是激活免疫细胞(单核细胞 / 巨噬细胞)分泌炎症因子，而 NF-κB 是介导该过程的核心信号分子 —— 多数热原(如革兰氏阴性菌内毒素 LPS、革兰氏阳性菌脂磷壁酸 LTA、真菌酵母聚糖等)均通过激活 NF-κB 诱导炎症反应。基于此，本研究构建人单核细胞系 THP-1 转染 NF-κB 调控的荧光素酶报告基因，建立新型体外热原检测方法，解决传统方法的缺陷。

研究方法

转基因细胞系构建与筛选：通过重叠 PCR 合成 NF-κB 响应元件，插入荧光素酶报告基因质粒 pCM1.1_luc_hygro，构建 pCM1.1_luc_NFκB_hygro 质粒;将该质粒电转 THP-1 细胞，用 200μg/ml 潮霉素筛选 2-3 个月，有限稀释法获得单克隆细胞;以 “信号噪声比(SNR 高、背景低、生长良好)” 为标准，通过 LPS 刺激筛选对热原敏感的亚克隆，最终选择 2D5 亚克隆(THP-1_NF-κB_luc 细胞)用于后续实验。

实验参数优化：测试不同细胞密度(2×10⁴、4×10⁴、6×10⁴、8×10⁴细胞 / 孔)和热原刺激时间(6、12、24、36h)对 NF-κB 响应(荧光素酶活性，RLU 值)的影响;以低浓度 LPS(0.125 EU/ml)的响应显著性、高浓度热原(8 EU/ml LPS、100 μg/ml LTA / 酵母聚糖)的响应最大值为指标，确定最佳实验参数为 4×10⁴细胞 / 孔、24h 刺激。

方法性能验证：

① 热原检测范围：测试 11 种不同菌株 LPS(如大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌)和 5 种非内毒素热原(脂磷壁酸 LTA、酵母聚糖、肽聚糖、植物凝集素、β-1,3 - 葡聚糖)的剂量效应关系，计算响应变异系数(CV);

② 细胞稳定性：检测 P11-P39 代细胞对 LPS 的剂量响应及 P6-P37 代细胞 TLR1-10 表达(流式细胞术);

③ 实验室精密度：检测 0.125-8.0 EU/ml LPS 的 intra/inter assay CV，验证浓度 - 响应线性关系;

④ 生物制品适用性：对 7 种生物制品(A/C 群脑膜炎球菌多糖疫苗、巴利昔单抗、冻干人用狂犬病疫苗等)进行 LPS 回收率试验，回收率 50%-200% 判定为无干扰;

⑤ 多实验室验证：3 个独立实验室(中国食品药品检定研究院、上海市食品药品检验研究院、成都凯莫生物医药)检测 4 种盲样药物，计算实验室内部重复性(3 次重复检测一致率)、实验室间重复性(两两实验室一致率)及灵敏度(真阳性率)、特异性(真阴性率)。

检测流程：对数期 THP-1_NF-κB_luc 细胞离心收集，用含 1% FBS 的 RPMI 1640 重悬至 4×10⁴细胞 / 孔，接种 96 孔板(50 μL / 孔);加入样品溶液(50 μL / 孔，n=3-4)，37℃、5% CO₂孵育 24h;每孔加 100μl Bright-Glo 荧光素酶试剂，振荡 2min 后，用 SpectraMax i3X 酶标仪测 RLU 值，以 LPS 标准曲线定量热原浓度。

实验结果

图1：建立对 LPS 敏感的 THP-1_NF-κB_luc 细胞亚克隆

图 1a 显示 THP-1_NF-κB_luc 细胞混合池对细菌内毒素国家标准品(LPS)呈剂量依赖性 NF-κB 响应(n=3);

图 1b 从 36 个单克隆中筛选出 6 个对 LPS 响应较高的亚克隆(1C6、1D4、1D6、1E6、2B8、2D5);

图 1c 显示亚克隆 2D5 对 LPS 的剂量响应最佳(线性关系显著)，而 1C6 因背景过高、2B8 无剂量依赖性被排除，最终确定 2D5 亚克隆用于后续实验。

图2：实验参数确认及细胞对内外毒素热原的响应

图 2a-c 分别显示不同细胞密度下，LPS(内毒素)、LTA(非内毒素)、酵母聚糖(非内毒素)刺激的 NF-κB 响应：24h 刺激时，4×10⁴细胞 / 孔的响应值最大且背景低，6h、12h 响应不足，36h 背景升高;

图 2d 显示 11 种不同菌株 LPS(如大肠杆菌 O26:B6、沙门氏菌肠炎亚种等)和 5 种非内毒素热原(肽聚糖、凝集素、葡聚糖等)均与 NF-κB 响应呈显著剂量效应，CV 范围 4%-25%，且测试浓度范围内无细胞毒性，证实该方法可检测多种类型热原。

图3：细胞传代稳定性

图 3a 显示 P11、P15、P33、P39 代细胞对 LPS 的剂量响应稳定，检测限(LOD)均为 0.0625 EU/ml(与阴性对照比 P=0.005)，RLU 值 CV<20%;

图 3b 显示 P6、P16、P28、P37 代细胞表面 TLR1-10(模式识别受体，介导热原识别)表达无显著差异(流式检测)，证实细胞的热原响应性和表型在长期传代中稳定。

研究结论

本研究建立的基于 THP-1_NF-κB_luc 转基因细胞系的热原检测方法，具有显著优势：

① 检测范围广，可同时检测内毒素(不同菌株 LPS)和非内毒素热原(LTA、酵母聚糖等)，弥补 BET 的局限性;

② 稳定性强，细胞传代 39 代仍保持对热原的敏感响应，TLR 表达稳定，解决 MAT 的个体差异问题;

③ 适用性高，对 7 种生物制品(疫苗、单克隆抗体、重组蛋白等)无干扰，LPS 回收率符合要求;

④ 重复性与准确性好，实验室内部重复性 80%-85%、实验室间重复性 83.3%-95.6%，灵敏度 89.9%、特异性 90.9%，优于传统 RPT(灵敏度 57.9%);

⑤ 操作简便，仅需 1.5-2h 完成样品制备与检测，易于标准化。该方法为传统热原检测提供了新型替代方案，可满足注射类药物的安全控制需求。