突破！丝蛋白支架构建人类卵巢 3D 模型，长期培养再现血管生成，为生育力保护铺路

建立模拟卵巢的体外模型对阐明卵泡激活和生长机制至关重要，而 3D 系统因能复现卵巢细胞异质性和细胞间通讯备受关注。来自瑞典卡罗林斯卡研究所的 Valentina Di Nisio 团队(Andres Salumets 为通讯作者)在 bioRxiv(2024 年预印本)发表研究，首次利用丝蛋白(Biosilk)支架构建了人类卵巢原代细胞的长期 3D 培养模型 ——Silk-Ovarioids。该模型包含颗粒细胞、基质细胞、内皮细胞等关键体细胞类型，形成促血管生成的缺氧核心，培养 6 周后出现血管样结构，且批内差异小、稳定性高，为构建个性化人工卵巢迈出重要一步，为卵巢生物学研究和临床应用提供了全新工具。

本研究旨在开发并表征基于人类卵巢原代细胞的长期 3D 培养模型。方法包括：比较三种 3D 培养系统 —— 无基质卵巢球体(MFOS)、Matrigel 三层梯度系统(3LGS)和丝蛋白支架悬浮球体(Silk-Ovarioids)，最终筛选出 Silk-Ovarioids;通过转录组学、蛋白质组学和免疫染色验证模型中关键体细胞类型;分析其缺氧环境、血管生成能力、细胞外基质(ECM)形成及细胞因子、类固醇分泌功能。结果显示，Silk-Ovarioids 可长期培养(42 天)，保留卵巢主要体细胞类型，形成功能性缺氧核心和血管样结构，为卵巢再生研究提供了可靠模型。

研究背景

女性生育潜力依赖于卵巢储备(皮质中休眠卵泡库)，而自然衰老、疾病或治疗可导致卵巢储备减少，甚至早发性卵巢功能不全(POI)。目前卵巢组织冷冻移植是青春期前癌症患者保留生育力的唯一选择，但系统性恶性肿瘤患者存在肿瘤细胞再引入风险，亟需体外卵泡培养等替代方案。

现有体外模型多基于动物细胞，人类模型存在局限：难以维持卵泡结构、缺乏标准化，且无法长期培养。卵巢功能依赖 ECM(如层粘连蛋白、胶原)支持，而 3D 模型需模拟这一微环境。本研究创新性地采用丝蛋白支架，成功构建人类卵巢原代细胞 3D 模型，填补了人类卵巢长期稳定 3D 培养的空白。

实验结果

图 1：实验设计概述

该图展示研究整体框架：从 5 名接受性别确认手术的患者获取卵巢组织，分离皮质和髓质细胞，分别构建 2D 培养和三种 3D 模型(MFOS、3LGS、Silk-Ovarioids);通过转录组学、蛋白质组学、免疫染色等方法验证模型细胞类型、功能及分泌产物。实验设计明确对比不同培养系统的优劣，最终聚焦 Silk-Ovarioids 的深入表征。

图 2：卵巢原代细胞 3D 培养系统比较

该图显示三种培养系统的效果：(a)MFOS 可形成 100-250μm 球体，但 2 周后自发解体;(b)3LGS 仅髓质细胞可形成 100-200μm 球体，11 天后解体，皮质细胞无法形成球体;(c-e)Silk-Ovarioids 构建流程：丝蛋白支架接种细胞后先贴壁培养 2 周，再悬浮培养 4 天开始压缩，最终形成 400-1000μm 稳定结构，可培养 42 天;(f-g)H&E 染色证实 Silk-Ovarioids 内部细胞完整;(h-i)免疫荧光显示模型中存在缝隙连接(ZO-1)，凋亡细胞少(TUNEL 阴性)，增殖细胞主要位于外层(Ki67 阳性)。结果证实仅 Silk-Ovarioids 能支持人类卵巢原代细胞长期稳定培养。

图 3：Silk-Ovarioids 中的细胞类型鉴定

该图验证模型中的细胞组成：(a)基于单细胞 RNA-seq 数据，筛选出基质细胞(PDGFRA)、颗粒细胞(AMHR2)、内皮细胞(GPIHBP1、CLDN5)、血管周细胞(MCAM、GJA4)的特异性标记物;(b)RNA-FISH 显示这些标记物在皮质和髓质来源的 Silk-Ovarioids 中均有 mRNA 表达，其中 PDGFRA 信号强，AMHR2 信号弱(提示颗粒细胞占比低);(c)免疫荧光证实上述标记物的蛋白表达，内皮细胞与血管周细胞标记物定位邻近;培养 6 周后，皮质来源的 Silk-Ovarioids 核心出现 CLDN5 和 GPIHBP1 阳性的血管样结构。结果证实模型包含卵巢关键体细胞类型，并具备血管生成潜能。

图 4：转录组学分析揭示 Silk-Ovarioids 的分子特征

该图通过 RNA-seq 比较组织、2D 培养和 Silk-Ovarioids 的基因表达：(a-b)主成分分析(PCA)显示新鲜组织与培养样本明显分离;GSEA 分析发现，与组织相比，2D 和 3D 培养均上调细胞周期 G2M 检查点、血管生成、缺氧等通路，而 Silk-Ovarioids 特有的上调通路包括皮质中的 IL6-JAK-STAT3 信号;(c)Silk-Ovarioids 的 G2M 和 S 期标记基因表达更高，提示增殖能力更强;(d)缺氧相关基因聚类显示，2D 培养富集应激相关基因(如 ROS 代谢)，而 Silk-Ovarioids 富集血管生成相关基因(如血管直径维持);(e)血管生成基因聚类显示，Silk-Ovarioids 高表达内皮分化、血管出芽相关基因。结果表明 Silk-Ovarioids 通过促血管生成而非应激性缺氧维持存活。

图 5：蛋白质组学验证缺氧与血管生成的关联

该图整合蛋白与 RNA 水平数据：(a)热图显示 Silk-Ovarioids 中血管生成相关蛋白(如 TGFBR2、BMP2)贡献度高，与转录组结果一致;(b)Pearson 分析证实缺氧和血管生成相关基因的蛋白与 RNA 表达呈中强相关;(c)免疫荧光显示，皮质来源的 Silk-Ovarioids 中，血管样结构形成后核心缺氧标记物(MMP2、PDGFRβ)下调，血管生成标记物共定位;髓质来源的模型中，未成熟血管周围仍存在缺氧核心。结果验证了 “缺氧核心诱导血管生成” 的功能关联。

图 6：Silk-Ovarioids 的细胞外基质(ECM)形成

该图分析 ECM 相关分子表达：(a)RNA-seq 显示，Silk-Ovarioids 中 COL1A1(胶原 1α1)和 LAMA1(层粘连蛋白 α1)的 mRNA 表达显著高于组织;(b)蛋白质组学证实 Col1α1 蛋白表达趋势与 RNA 一致;(c)免疫荧光显示 Col1α1 与 Lamα1 在模型核心和外层共定位。结果表明模型能自主合成并重塑 ECM，模拟卵巢微环境结构。

图 7：Silk-Ovarioids 分泌促血管生成细胞因子和类固醇

该图检测分泌功能：(a)培养 42 天的上清液中，IL-6、IL-8、MCP-1 等促血管生成细胞因子浓度最高;(b)RNA-seq 显示这些细胞因子的编码基因在 Silk-Ovarioids 中高表达;类固醇检测发现孕烯醇酮和表睾酮可检出，雌激素检出率低，对应 CYP11A1(孕烯醇酮合成酶)和 CYP19A1(芳香化酶)的表达特征。结果证实模型具备内分泌功能，分泌的细胞因子可进一步促进血管生成。

图 8：缺氧与血管生成的调控网络及模型概述

该图构建分子互作网络并总结模型特征：(a-b)基因 - 概念网络显示，STC1 和 VEGFA 是连接缺氧与血管生成的核心基因，二者均参与卵泡激活;(c)示意图展示 Silk-Ovarioids 的关键机制：丝蛋白支架支持细胞存活，自主合成 ECM，形成缺氧核心诱导血管生成，血管样结构改善氧供形成负反馈，最终构建支持卵泡生长的微环境。

研究结论

Silk-Ovarioids 是首个能长期稳定培养的人类卵巢原代细胞 3D 模型，包含基质细胞、内皮细胞等关键体细胞类型，通过形成缺氧核心诱导血管生成，自主合成 ECM，并分泌促血管生成细胞因子和类固醇。该模型为研究卵巢生物学、筛选卵巢毒性药物及构建人工卵巢提供了可靠工具，有望推动生育力保存和卵巢疾病治疗的发展。