3D 打印 + 冻干技术！新型气管支架实现精准细胞分层种植，助力组织再生

气管组织工程的有效发展依赖于能模拟天然结构、提供力学稳定性并支持精准细胞分层种植的支架。来自爱尔兰皇家外科医学院的团队在《ACS Biomaterials Science & Engineering》(2025 年)发表研究，开发了一种新型管状支架：通过 3D 打印聚己内酯(PCL)骨架与冻干胶原 - 透明质酸(CHyA)层结合，制备管状和 C 形两种几何结构。该支架力学性能显著增强，且通过定制 PLA 配件实现呼吸道上皮细胞(Calu-3)在内层、肺成纤维细胞(Wi38)在外层的精准种植，成功建立共培养体系。该方法为气管再生提供了可扩展、定制化的平台，也适用于血管、胃肠道等其他管状组织工程。

本研究旨在开发用于气管再生的管状支架，解决现有支架力学性能不足和细胞种植空间控制差的问题。方法包括：3D 打印 PCL 骨架(管状和 C 形)，结合冻干 CHyA 层构建复合支架;表征支架力学性能(压缩强度、循环稳定性);利用定制 3D 打印 PLA 配件，将 Calu-3 细胞种植于支架内层、Wi38 细胞种植于外层，通过单培养和共培养验证细胞存活与分布。结果显示，PCL 增强显著提升支架力学稳定性，分层种植实现上皮细胞高覆盖率和成纤维细胞存活，共培养体系进一步优化细胞功能，为气管组织工程提供了实用方法。

研究背景

气管损伤(如创伤、先天性畸形)的修复需支架满足：模拟天然管状结构、提供足够力学支撑(抵抗呼吸压力)、支持分层细胞生长(内层上皮、外层支持组织)。现有技术存在局限：单纯天然材料支架力学薄弱，单纯合成材料生物相容性不足，且细胞种植难以实现精准分层，导致再生效果不佳。

3D 打印技术可定制支架结构，冻干技术能构建多孔网络，二者结合或可解决力学与生物相容性矛盾。本研究创新点在于：将 3D 打印 PCL(力学支撑)与冻干 CHyA(生物相容性)结合，设计定制种植配件实现细胞分层定位，首次实现气管支架的力学性能与精准细胞种植双重优化，填补了相关技术空白。

实验结果

图 1：管状支架的细胞种植策略

该图展示细胞分层种植流程：(A)Wi38 成纤维细胞种植于外层(OL)：支架置于定制 PLA 配件中，通过旋转(1 rpm，2 小时)确保细胞附着于外层，配件屏蔽内层避免污染;(B)Calu-3 上皮细胞种植于内层(IL)：支架置于另一配件中，旋转(0.5 rpm，4 小时)使细胞定植于内层，屏蔽外层;(C)共培养流程：先种植 Wi38(第 - 2 天)，再种植 Calu-3(第 0 天)，随后维持液 - 液界面培养 10 天。该策略通过物理隔离实现细胞精准分层，为后续单培养和共培养奠定基础。

图 2：支架的力学性能表征

该图验证 PCL 增强对支架力学的提升：(A)纵向压缩测试显示，PCL-CHyA 支架(管状和 C 形)的压缩模量显著高于纯 CHyA 支架，两种几何结构间无显著差异;(B)径向压缩测试中，PCL-CHyA 支架的峰值载荷(约 5 N)接近人类气管水平，显著高于纯 CHyA 支架;(C)循环加载测试(250 次，模拟呼吸运动)显示，PCL-CHyA 支架的力学性能无明显衰减，而纯 CHyA 支架强度下降显著。结果证实，PCL 骨架有效提升支架的力学稳定性，可抵抗生理条件下的反复压力。

图 3：支架的超微结构分析

该图展示支架的多孔结构：(A-D)SEM 图像显示，纯 CHyA 支架(A、B)和 PCL-CHyA 支架(C、D)均呈多孔网络，PCL 纤维与 CHyA 基质结合紧密;(E)孔隙尺寸分析显示，PCL-CHyA 支架的平均孔径(161.8 μm)显著大于纯 CHyA 支架(114.3 μm)，且处于 100-200 μm 的理想范围(适合细胞增殖和基质沉积)。结果表明，PCL 的加入未破坏多孔结构，反而优化了孔径，利于细胞浸润。

图 4：Calu-3 细胞在内层的种植效果

该图评估上皮细胞内层种植效率：(A)代谢活性显示，Calu-3 细胞在第 2、7、10 天的活性随时间升高，内层(IL)活性显著高于外层(OL);(B)第 10 天 DNA 定量证实，内层细胞密度显著高于外层;(C)覆盖率分析显示，1.25×10⁵ cells/cm² 种植密度时，内层覆盖率最高(约 60%);(D-G)共聚焦图像显示，无配件组(D)外层污染严重，而配件组(E-G)随密度升高，内层细胞分布更均匀，外层污染少。结果证实，定制配件可实现 Calu-3 细胞在内层的精准种植，低密度(1.25×10⁵ cells/cm²)效果最佳。

图 5：Calu-3 细胞在内层的分布验证

该图通过共聚焦显微镜进一步验证：(A)无配件组中，Calu-3 细胞在内外层均有分布;(B-D)配件组中，1.5×10⁵、3×10⁵、5×10⁵ cells/cm² 种植密度下，细胞主要集中于内层(DAPI 染色核蓝，鬼笔环肽染色 actin 红)，外层极少。结果直观证明配件能有效限制上皮细胞在外层的非特异性附着。

图 6：Wi38 细胞在外层的种植效果

该图评估成纤维细胞外层种植效率：(A)代谢活性显示，Wi38 细胞在第 1、5、7 天活性递增，外层(OL)活性显著高于内层(IL);(B)第 7 天 DNA 定量证实外层细胞密度更高;(C)覆盖率分析显示外层几乎无细胞污染内层;(D-F)共聚焦图像显示，6×10⁵ cells/cm² 密度时，外层细胞铺展最佳(呈典型成纤维细胞形态)，内层几乎无细胞。结果表明，配件可实现 Wi38 细胞在外层的高效种植，高密度(6×10⁵ cells/cm²)更利于细胞增殖。

图 7：4 小时共培养体系的细胞功能

该图展示共培养效果：(A)代谢活性显示，共培养组内层(IL)活性显著高于 Calu-3 单培养，外层(OL)活性略低于 Wi38 单培养;(B)内层覆盖率在共培养组(约 55%)高于单培养(约 40%);(C-E)共聚焦图像显示，共培养组内层 Calu-3 细胞排列更紧密，外层 Wi38 细胞存活良好。结果提示，细胞间通讯可能促进上皮细胞功能。

图 8：2 小时共培养体系的优化

该图调整 Calu-3 种植时间(缩短至 2 小时)：(A)代谢活性显示，共培养组外层(OL)活性与 Wi38 单培养无显著差异(解决图 7 中 OL 活性下降问题);(B)内层覆盖率达约 70%，显著高于 4 小时组;(D-F)图像显示，共培养组内层上皮连续性更好，外层成纤维细胞存活稳定。结果证实，缩短种植时间可减少对成纤维细胞的影响，优化共培养效果。

研究结论

本研究成功开发出力学稳定且支持精准细胞分层种植的气管支架：3D 打印 PCL 增强使支架具备抵抗呼吸压力的力学性能，定制 PLA 配件实现 Calu-3 上皮细胞(内层)和 Wi38 成纤维细胞(外层)的精准分布，共培养体系进一步优化细胞功能。该方法可扩展至血管、胃肠道等管状组织工程，为复杂组织再生提供了可推广的技术方案。