不用处死小鼠！RSV 复制动态，活体成像一眼看清

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice

中文标题：呼吸道合胞病毒(RSV)复制的可视化研究：细胞与活体小鼠中的重组病毒工具构建与应用

发表期刊：《Nature Communications》

影响因子：15.7

作者单位：

1. Unite´ de Virologie et Immunologie Moleculaires (UR892), INRA, Jouy-en-Josas F78352, France

2. Physiopathologie et diagnostic des infections microbiennes, EA3647-EPIM, UFR des Sciences de la Sante´ Simone Veil-UVSQ, 2. avenue de la Source de la Bie`vre, 78180 Montigny-Le-Bretonneux, France

3. AP-HP, Hoˆpital Ambroise Pare´, Laboratoire de Microbiologie, Boulogne-Billancourt 92100, France

作者信息：

Marie-Anne Rameix-Welti, Ronan Le Goffic, Pierre-Louis Herve

研究背景

呼吸道合胞病毒(RSV)是全球婴幼儿和犊牛严重下呼吸道疾病(支气管炎、肺炎)的首要病因，每年导致大量婴幼儿住院，但目前尚无获批人用疫苗，仅有的预防药物(帕利珠单抗)价格昂贵，治疗药物(利巴韦林)毒性强且应用受限。现有 RSV 检测与抗病毒筛选方法(如细胞病变观察、空斑减少实验、qRT-PCR)繁琐、耗时且成本高，缺乏能实时监测病毒复制的工具。本研究基于反向遗传学技术，构建表达红色荧光蛋白(mCherry)或萤火虫荧光素酶(Luc)的重组 RSV(rHRSV-Cherry、rHRSV-Luc)，实现 RSV 在细胞中复制的快速监测及活体小鼠中复制的实时可视化，为抗病毒药物筛选和体内药效评估提供高效工具。

研究方法

重组 RSV 构建：通过反向遗传学技术，将 RSV Long 株全长抗原 omic cDNA 克隆至 pACNR1180 载体，在 P 与 M 基因间插入含 RSV 基因起始(GS)/ 终止(GE)信号的 mCherry 或 Luc 基因;与表达 N、P、L、M2-1 蛋白的辅助质粒共转染 BSRT7/5 细胞，拯救重组病毒。

体外实验：在 HEp-2 细胞上测定重组病毒与野生型 RSV 的生长曲线(MOI=0.01，48h 达峰值);用荧光显微镜 / 酶标仪检测 mCherry 荧光(激发 580nm / 发射 620nm)，裂解细胞后加 D - 荧光素检测 Luc 活性(相对光单位 RLU)，分析报告基因信号与病毒滴度的相关性。

抗病毒筛选：用 RSV 聚合酶抑制剂 AZ-27 和融合抑制剂 AZD4316 处理感染细胞，通过报告基因活性下降计算 EC₅₀，并与传统空斑减少实验验证;用 CellTiter-Glo 检测药物细胞毒性(CC₅₀)。

体内实验：BALB/c 小鼠鼻内感染 5×10⁴ p.f.u. rHRSV-Luc，鼻内注射 D - 荧光素后用 IVIS 成像系统监测生物发光;qRT-PCR 检测肺组织病毒载量，验证成像结果;口服 AZD4316(50mg/kg)评估体内抗病毒效果。

统计分析：用 KaleidaGraph 软件拟合 EC₅₀，Student’s t 检验 / Mann-Whitney U 检验分析差异(p<0.05 为显著)。

实验结果

图1：重组 RSV 的构建示意图展示 RSV Long 株抗原 omic cDNA 的构建

在基因组间插入 7 个独特酶切位点(如 MluI、StuI)便于基因操作，将 mCherry 或 Luc 基因(两侧含 GS/GE 信号)插入 P 与 M 基因间的 MluI 位点;载体上游含 T7 启动子，下游含 HDV 核酶序列以保证转录产物正确切割，最终构建 rHRSV-Cherry 和 rHRSV-Luc 重组质粒，可转录出含报告基因的完整病毒 RNA。

图2：重组RSV生长特性及报告基因表达稳定

重组 RSV 的生长特性与报告基因表达生长曲线显示，重组病毒(rHRSV、rHRSV-Cherry、rHRSV-Luc)与野生型 RSV Long 株在 HEp-2 细胞上复制能力无显著差异，48h 病毒滴度均达 5.8-6.3 Log p.f.u./ml;空斑形态相似，直径无显著差异;rHRSV-Cherry 感染后 24h 可观察到红色荧光，48-72h 荧光强度持续升高;rHRSV-Luc 的 Luc 活性在 24-72h 稳定上升，报告基因表达在 8 次传代后仍稳定，证实插入报告基因不影响病毒复制。

图3：报告基因信号与病毒滴度相关性确定

报告基因信号与病毒滴度的相关性剂量反应曲线显示，rHRSV-Cherry 在 50-1000 p.f.u./ 孔范围内，荧光信号(RFU)与病毒滴度呈线性相关(48h 检测最优);rHRSV-Luc 的线性范围更宽(5-3000 p.f.u./ 孔)，RLU 值覆盖 > 3 个数量级，24h 检测信号最稳定(72h 因细胞病变信号下降);后续实验确定 rHRSV-Cherry 用 500 p.f.u./ 孔、48h 读荧光，rHRSV-Luc 用 1000 p.f.u./ 孔、24h 读发光。

图4：重组RSV用于药物筛选及结果可靠

重组 RSV 用于抗病毒药物筛选AZ-27 和 AZD4316 处理后，rHRSV-Luc 的发光信号、rHRSV-Cherry 的荧光信号均呈剂量依赖性下降;AZD4316 的 EC₅₀为 1.0 nM(rHRSV-Cherry)和 1.7 nM(rHRSV-Luc)，AZ-27 的 EC₅₀为 28 nM(rHRSV-Cherry)和 38 nM(rHRSV-Luc)，与传统空斑减少实验结果(AZ-27 EC₅₀=14 nM、AZD4316 EC₅₀=0.6 nM)一致;药物 CC₅₀远高于 EC₅₀(AZ-27 CC₅₀>250 μM，AZD4316 CC₅₀≈50 μM)，证实筛选方法可靠。

图5：活体小鼠rHRSV-Luc复制可视化及验证

活体小鼠中 rHRSV-Luc 复制的可视化BALB/c 小鼠鼻内感染 rHRSV-Luc 后，IVIS 成像显示：3 天 post infection(dpi)鼻端生物发光达峰值，4-5 dpi 肺部发光最强，7 dpi 仍可检测到信号，野生型 RSV 感染小鼠无发光;小鼠体重无显著下降(无明显发病症状);肺组织 qRT-PCR 验证显示，生物发光强度与病毒载量呈强相关(Spearman r=0.941，p=0.017);解剖发现仅肺组织有发光信号，肝、脾无信号，证实 RSV 仅在呼吸道复制。

图6：rHRSV-Luc实时监测AZD4316体内药效

rHRSV-Luc 用于体内抗病毒药效评估小鼠感染前 1h 口服 AZD4316(50 mg/kg)，3 dpi 时肺部生物发光显著降低(药物处理组 159200±13636 p/s，未处理组 1.2×10⁶±89500 p/s);Mock 感染小鼠信号极低(83050 p/s);结果证实 rHRSV-Luc 可实时监测体内药物对 RSV 复制的抑制效果，且 AZD4316 能阻止 RSV 从鼻咽部向肺部扩散，达到预防下呼吸道感染的目标。

研究结论

本研究成功构建的重组 RSV(rHRSV-Cherry、rHRSV-Luc)具有三大核心优势：

1. 插入报告基因不影响病毒复制，报告基因活性与感染效率高度相关;

2. 体外可快速、灵敏筛选抗病毒药物，EC₅₀与传统方法一致，适合高通量检测(rHRSV-Luc 灵敏度更高，rHRSV-Cherry 成本更低);

3. 体内可通过生物发光成像实时监测 RSV 在小鼠呼吸道的复制，减少动物用量且无需处死动物。该工具为 RSV 抗病毒药物研发、体内感染机制研究提供了高效手段，未来可通过融合流行 RSV 株基因(如 Line 19、Memphis 37)进一步优化模型，适配疫苗评估需求。