Shh激动剂增强同型Lgr5阳性内耳类器官的成熟

感音神经性耳聋主要由耳蜗毛细胞(HCs)的不可逆损伤引起，这仍然是一个重大的临床挑战。毛细胞是特化的感觉细胞，通过机械电转导将机械刺激转换为电信号，这一过程由其顶端的纤毛束介导。当内淋巴流动引起纤毛偏转时，会激活离子通道，产生传递到大脑的电信号。再生医学研究一直致力于恢复这些丧失的毛细胞以解决感音神经性耳聋问题。一个有前景的方法是使用源自祖细胞或干细胞的类器官培养，它们可以自组织成三维结构，重现本地组织架构和功能的关键方面。

内耳类器官已成功地从胚胎干细胞(ESCs)中产生，但这些类器官往往导致异质性细胞群体，使得专注于耳蜗毛细胞发育变得具有挑战性。为克服这一局限，研究已转向使用祖细胞，作为耳蜗毛细胞再生的更具针对性的来源。亮氨酸富含重复-含G蛋白偶联受体5(Lgr5)是耳蜗感觉祖细胞的标志物，在毛细胞发育和再生中发挥重要作用。然而，在同型类器官中实现功能性成熟毛细胞的主要挑战是促进纤毛的适当成熟，这对毛细胞功能至关重要。

近期，发布在Theranostics期刊，题为Shh agonist enhances maturation in homotypic Lgr5-positive inner ear organoids的文章阐明了支持耳蜗毛细胞成熟和功能性内毛细胞发育的关键途径和细胞动态。这些发现为内毛细胞成熟的分子调控提供了新的见解，并支持Shh调节的IEO作为内耳再生和治疗开发的有前景平台。

图示描述

1，研究团队首先比较了通过两种不同方法分离的Lgr5阳性细胞(LPCs)：手动分离(MI)和磁活化细胞分选(MACS)。FACS分析显示，MI方法分离的细胞中只有13.15%为Lgr5阳性，而MACS方法达到了96.07%的纯度。这两组细胞均能形成球体，但MI组显示出疏散的Sox2表达，而MACS组则表现出更一致的Sox2表达。当进行毛细胞分化时，MI组的球体发展出表达特征性毛细胞标志物Myo7a的细胞，并形成了类似于天然纤毛的F-actin富集突起。相比之下，MACS组虽然也产生了Myo7a阳性细胞，但显著缺乏F-actin纤毛束结构。功能性评估通过FM1-43摄取实验进行，结果显示MI组表现出强烈的FM1-43摄取，表明具有功能完整性，而MACS组则表现出最小限度的摄取，提示功能特性缺乏。

图1 Lgr5阳性细胞的分离

2，为了深入了解两组间的转录差异，研究者进行了批量RNA测序分析。结果显示，MACS与MI组相比，存在690个上调和291个下调的差异表达基因。特别是MACS组中与组织形态发生相关的基因(如Fgf10、Gata3、Tmprss3和Shox2)表达下降，这些基因对于细胞分化和器官发生至关重要。基于这些发现，研究团队修改了MACS培养条件，增加了Sonic Hedgehog(Shh)激动剂purmorphamine，并结合Wnt信号通路的调控，以改善毛细胞分化。在经过Shh处理后，MACS衍生的类器官发展出明显的毛细胞样形态学特征，包括延长的纤毛束，表明向感觉毛细胞样群体分化。免疫染色显示F-actin(绿色)和Myo7a(红色)形成了束状的纤毛样结构，而FM1-43摄取实验证明了机械转导活性的存在。

图2 LPCs分化为HCs

图3 MACS分离的转录组分析

3，电子显微镜研究进一步证实了Shh处理的类器官中毛细胞的超微结构特征。透射电镜显示这些类器官发展出具有良好形成的纤毛束的毛细胞，平均长度为1.0±0.28μm，明显长于其他改良处理组。在纤毛束中观察到可能是中心纤毛的结构，显示了1+8微管构型，表明这些毛细胞源自支持细胞的转分化。还观察到连接纤毛与角质层的根部结构，以及将纤毛相互连接的可能的纤毛连接。扫描电镜进一步揭示了类器官中毛细胞的复杂组织和结构，包括具有明显"阶梯状"轮廓的纤毛束和V形排列的毛细胞。

图4 同质耳蜗祖细胞Lgr5阳性内耳类器官的示意图和表征

4，批量RNA测序分析揭示了MACS对照组与Shh处理组之间的分子生物学差异，识别出755个上调和55个下调的差异表达基因。在533个已知的毛细胞相关基因中，19个在Shh处理组中显著上调，包括Eya4、Lrba、Lmo7和Pls1，这些基因对感觉毛细胞、纤毛和角质层发育至关重要。相比之下，只有6个基因在MACS对照组中高表达，其中包括Gpx2和S100a1，它们在耳蜗毛细胞分化中的作用尚不清楚。单细胞RNA测序(scRNA-seq)进一步确定了多个细胞亚群，包括表达纤毛相关基因(Espn、Lhfpl5、Loxhd1和Tmc1)的独特毛细胞群体，表明纤毛成熟度提高。

图5 通过scRNA-seq揭示的暴露于Shh激动剂的分化HCs的细胞类型聚类

5，为评估Shh处理的MACS衍生内耳类器官的功能整合，研究人员将类器官与原代螺旋神经节神经元(SGNs)共培养，形成组装体。微电极阵列记录显示，这些组装体表现出显著高于类器官单独培养(22.1μV)和SGN单独培养(17.5μV)的自发电活动(57.9μV)，接近耳蜗外植体的水平(66.5μV)。CtBP2(红色，突触前带状蛋白)和NF-H(紫色，神经元投射)的免疫荧光染色证实了毛细胞样结构与SGNs之间的突触接触点的存在。透射电镜进一步显示了毛细胞膜附近的类突触前带状结构，而前突触(CtBP2)和后突触(PSD95)标记的共定位支持组装体中发生了突触生成。

图6 通过scRNA-seq揭示的暴露于Shh激动剂的分化HCs的细胞类型聚类

全文总结

本研究阐明了分子和功能机制在同型Lgr5阳性耳蜗祖细胞衍生的内耳类器官中纤毛成熟的过程。通过整合转录组和功能分析，研究证明了Shh信号通路结合Wnt抑制在促进这些类器官的纤毛形成和功能成熟中起着至关重要的作用。研究表明角质层对纤毛组织和稳定性至关重要，因为它触发了必需结构蛋白的显著增加。通过Shh处理的调控导致纤毛具有更清晰的结构定义和改善的角质层完整性，这一点通过超微结构成像技术结合单细胞RNA测序和电生理评估得到证实。此外，内耳类器官与螺旋神经节神经元共培养时，展示了通过突触连接的神经整合潜力，这有利于功能恢复能力。这些发现为内耳再生的分子机制提供了宝贵的见解，并为推进感音神经性耳聋的细胞疗法提供了强大的平台。