延长 I 型干扰素信号！THP-1 报告细胞系助力疫苗辅佐剂筛选

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Identification of Compounds that Prolong Type I Interferon Signaling as Potential Vaccine Adjuvants

中文标题：筛选延长 I 型干扰素信号的化合物作为潜在疫苗佐剂：THP-1 ISRE-bla 报告细胞系的构建与应用

发表期刊：《SLAS Discovery》

影响因子：2.7

作者单位：

1. Moores UCSD Cancer Center, University of California San Diego, La Jolla, CA 92093-0695, USA

2. Department of Family Medicine and Public Health, Division of Biostatistics and Bioinformatics, University of California San Diego, La Jolla, CA 92093-0901, USA

3. Department of Pathology, Division of Biological Sciences, University of California San Diego, La Jolla, CA 92093-0815, USA

4. Department of Medicine, University of California San Diego, La Jolla, CA 92093-0656, USA

作者信息：

Nikunj M. Shukla, Kei-Ichiro Arimoto, Shiyin Yao

研究背景

疫苗佐剂对增强抗原免疫应答至关重要，尤其能改善老年人等免疫功能低下人群的疫苗效果(如 FDA 批准的 MF59 佐剂流感疫苗 Fluad™)，而 I 型干扰素(IFN)已被证实是强效疫苗佐剂，可增强流感疫苗免疫效果。但现有研究存在局限：此前高通量筛选(HTS)多使用肺癌或肉瘤细胞系，仅聚焦 “诱导 IFN 产生”(检测时间≤8h)，未针对抗原提呈细胞(APC)相关细胞系筛选 “延长已激活 IFN 信号” 的化合物;且 APC 迁移至引流淋巴结时 IFN 信号会衰减，延长该信号可能进一步增强适应性免疫应答。基于此，本研究构建人单核细胞系 THP-1 衍生的干扰素刺激反应元件(ISRE)-β- 内酰胺酶(bla)报告细胞系(THP-1 ISRE-bla)，通过 HTS 筛选能延长 IFN-α 诱导的 ISRE 激活的化合物，验证其作为疫苗辅佐剂的潜力。

研究方法

首先构建 THP-1 ISRE-bla 细胞系：用慢病毒将 ISRE-bla 报告基因转导至 THP-1 细胞，经杀稻瘟菌素筛选稳定克隆，通过 USP18 过表达(MIP 载体，降低 STAT1 磷酸化)和敲低(shRNA，延长 STAT1 磷酸化)验证细胞对 IFN 信号的响应性;随后优化 HTS 条件，确定 40000 细胞 / 孔、5% FBS、16h 孵育(IFN 16h 组 0h 加 IFN-α，IFN 6h 组 10h 加 IFN-α)、3h FRET 底物孵育后检测荧光(激发 405nm，发射 465/535nm)，以 “IFN 6h” 为 100% 激活、“无 IFN + 细胞” 为 0%，Ind-ratio≥1.4 且 95% 置信区间下限≥1.0 为阳性，对 172145 个化合物进行筛选;之后验证 Hit 化合物：MTT 法检测 5μM 化合物处理 THP-1 细胞的存活率(≥70% 为无毒)，Quantigene/qPCR 检测 IFN 诱导基因(ISG15、ISG56 等)，免疫印迹检测 ISG15 蛋白和 STAT1 磷酸化水平;最后进行体内实验：C57BL/6 小鼠(n=5 / 组)于 0、7 天肌肉注射 OVA(20μg / 只)、LPS(3μg / 只)及候选化合物(100nmol / 只)，17 天 ELISA 检测血清 OVA 特异性 IgG1/IgG2c，统计用单因素 ANOVA+Dunnett 事后检验(p<0.05 为显著)。

实验结果

图1：THP-1细胞实验全流程示意图展示

实验流程示意图展示从 THP-1 ISRE-bla 细胞构建→可行性验证→assay 优化→试点筛选(14,597 个化合物)→主筛选(172,145 个化合物)→结构富集 + Top X 方法筛选 2026 个化合物进行确认→265 个阳性化合物→毒性 / 基因 / 蛋白验证→小鼠体内辅佐剂实验的完整流程。

图2：THP-1细胞系验证及assay最佳条件

THP-1 ISRE-bla 细胞系可行性验证USP18 过表达显著降低 IFN-α 诱导的 STAT1 磷酸化(图 2A)，USP18 敲低显著延长 STAT1 磷酸化(图 2B)，证实细胞对 IFN 信号的调控响应;优化实验显示：40000 细胞 / 孔(图 2C)、5% FBS(图 2D)、3h 底物孵育(图 2E)、16h 总刺激时间(信号衰减显著，与 IFN 6h 差异最大，图 2F)为最佳 assay 条件。

图3：HTS assay优化及protocol确定

HTS assay 优化30h 刺激时间信号完全衰减，12h 信号衰减不足，16h 时 “IFN 16h”(衰减信号)与 “IFN 6h”(最大激活)差异最显著(图 3B);最终确定 assay protocol：细胞解冻后用 5% FBS 培养基培养 24h，40000 细胞 / 孔接种，0h 加 IFN-α(IFN 16h 组)和化合物，10h 加 IFN-α(IFN 6h 组)，16h 加底物，19h 检测荧光(图 3C)。

图4：HTS筛选结果及阳性化合物确认

HTS 筛选结果试点筛选(14,597 个化合物)中，“IFN 6h” 激活率显著高于 “IFN 16h”(图 4A)，主筛选 Z’值 0.50-0.90(中位数 0.71);通过结构富集(Murcko 骨架聚类 + 功能指纹聚类)和 Top X 方法，确认 265 个阳性化合物(图 4B);毒性检测显示多数化合物存活率≥70%(图 4C 左)，小鼠 BMDC 中化合物 3、5、24 显著上调 ISG15、ISG56 等 IFN 诱导基因(图 4C 右)。

图5：候选化合物剂量反应与机制验证

候选化合物剂量反应与机制验证化合物 3、5、24 在 IFN-α 存在时呈剂量依赖性延长 ISRE 激活，无 IFN 时无激活(图 5A);仅化合物 5 在 IFN-α 存在时呈剂量依赖性细胞毒性(CC₅₀=2954nM，图 5B);人 THP-1 细胞中，化合物 3、5、24 显著上调 ISG15/ISG56 mRNA(图 5C)，并增加 IFN-α 诱导的 ISG15 蛋白表达(图 5D);30min 时化合物 3、5、24 显著增强 STAT1 磷酸化，6h 仍有轻微残留(图 5E)，证实其延长 IFN 信号的机制与 STAT1 磷酸化相关。

图6：小鼠体内辅佐剂活性化合物验证

小鼠体内辅佐剂活性化合物 1-5 显著增强 OVA 特异性 IgG2c(p<0.01/p<0.05)，化合物 1-4、6、9 显著增强 IgG1(p<0.05);其中化合物 1-5 的 IgG2c 水平较 LPS 单独组提升约 1.5 个对数级，证实候选化合物可作为 LPS 的辅佐剂，增强抗原特异性体液免疫应答。

研究结论

本研究证实，多数半抗原(无论致敏强度)可诱导人THP-1细胞表达 IL-1α/β mRNA，仅极端和强致敏半抗原能诱导少量 IL-1β 蛋白分泌;构建的 THP-G1b 细胞系通过检测 IL-1β 启动子活性，在应用适用性域(排除酸酐、洗涤剂等特殊化合物)后，IL-1 Luc assay 的平衡准确率达 80.3%、灵敏度 94.0%、特异性 66.7%，性能优于传统 IL-8 Luc assay(OECD TG442E)。改良的 moIL-1 Luc assay 结合 Inh-GAPLA 后，特异性可提升至 82.6%，且 “不确定” 结果从 35 个减少至 14 个;将 moIL-1 Luc 与 moIL-8 Luc assay 联合采用 “2 out of 2” 策略(两种 assay 均判为阳性才定义为致敏剂)，对人类致敏潜力的阳性预测值达 100%。综上，THP-G1b 细胞系是高效的皮肤致敏预测工具，同时为皮肤致敏不良结局路径(AOP)中 “DC 激活” 关键事件提供了人类细胞层面的实验证据。