一种集成生物工艺生产人牙髓干细胞-海藻酸盐基底骨类器官

骨组织工程(BTE)作为一种解决假肢行业局限性的实用方法应运而生，它融合了发育生物学、工程学和医学的要素，旨在生产可用于研究和治疗目的的完全功能性的骨组织等效物。间充质干细胞(MSCs)因其自我更新和特定谱系分化的能力而成为BTE的潜在细胞来源。其中，人牙髓干细胞(hDPSCs)相较于骨髓间充质干细胞(hBM-SCs)具有更高的增殖率、更短的倍增时间、更低的细胞衰老率以及在特定条件下更强的成骨能力，且获取方式简便、道德争议少，是BTE疗法中替代hBM-MSCs的有前景的细胞来源。然而，关于hDPSCs在BTE中的研究相对有限，需要进一步探索其在设计能够生产临床规模的可行、均质骨构建体的生物过程中的真正价值。

2025年5月3日，发表在International Journal of Molecular Sciences上题为Engineering an Integrated Bioprocess to Produce Human Dental Pulp Stem Cell-Alginate-Based Bone Organoids的研究旨在开发一种新型的生物过程，以生产基于人牙髓干细胞(hDPSCs)的骨样构建体。

研究中，将hDPSCs封装在海藻酸盐水凝胶中，并在一种新型的灌注式生物反应器中进行悬浮培养，以研究其成骨分化能力。通过与传统的3D静态培养和补料批培养方法进行比较，发现该新型系统表现更优，能够产生更高的碱性磷酸酶活性，并形成更均匀、致密且功能性的骨构建体。此外，该系统生产的细胞构建体富含成熟的成骨细胞样和矿化成骨细胞样细胞。本研究为hDPSCs在骨组织工程中的治疗潜力提供了新的见解，并开发出一种能够从实验室转移到医疗设施的系统。

图示描述

1) 细胞活力分析和骨源性生物工艺。通过细胞活力测定和骨形成标记物表达评估了三种培养系统：静态三维培养(3D STAT)、高长宽比容器生物反应器(HARV)和自行设计的灌注旋转壁面生物反应器(P-RWV)。结果显示，到培养21天时，P-RWV产生的细胞数量显著高于其他两种工艺，比初始值增加约7倍，而HARV和3D STAT分别增加5.8倍和5倍。尽管到第28天时MTS活性下降，但这可能是骨组织自然发育过程中成骨细胞向骨细胞转化的结果。活/死细胞试验证实，培养期结束时，大部分细胞仍然存活并保持正常生理功能。

2) 组织学分析和矿化评估。通过H&E染色观察到三种生物工艺系统中细胞形态和组织发育的差异。初始时，大多数细胞未分化且均匀散布于珠粒中;随时间推移，细胞大小、形状以及周围环境发生变化，出现圆形腔隙，这是细胞分化的信号。3D STAT在第21天显示了一定数量的圆形腔隙形成，到第28天时增加，但出现空腔隙，细胞附着于烧瓶表面。HARV分化程度低于STAT，珠粒中可见的细胞较少。P-RWV表现出更成熟的形态，到第21天时，细胞完全填充了支架，除珠粒最内部区域外，形成了圆形腔隙，到第28天时，可以观察到大部分珠粒中的椭圆形腔隙。

3) 表面分析和微观结构特征。扫描电子显微镜(SEM)图像显示，骨源性培养后类器官中存在非化学计量的矿化沉积物，主要由钙和磷组成(通过X射线微分析证实)。此外，可清晰观察到腔隙和成骨细胞样细胞的形态发生。到第28天，腔隙分布在支架的大部分区域。在P-RWV培养中，可通过其小管(图4E,F)形态识别骨细胞样细胞。在STAT中，大比例的腔隙是空的(与H&E结果一致)。HARV显示细胞异质性和较不成熟的新生组织。

4) 矿化分析和骨标志物表达。通过茜素红S(ARS)和冯·科萨(VK)染色分析了矿化程度，结果显示三种工艺系统中的矿化沉积物广泛分布，随时间增加。STAT和P-RWV在28天内产生了较大的结节，而HARV产生了数量更多但较小的结节。VK结果虽然没有显示大量沉积(黑色)，但各系统的珠粒构造，特别是P-RWV，形成了大量分散的钙沉积(灰色)(图6)。骨钙素免疫染色进一步证实了成骨分化，到第28天，所有样本均为骨钙素阳性，其中P-RWV显示最高强度。

5) 定量对比和基因表达分析。碱性磷酸酶(ALPase)活性随时间增加，STAT显示最低增加。P-RWV达到了显著高于其他工艺的活性，为初始活性的7.3倍(图8)。通过ATR-FTIR和X射线微分析确认，矿化比较基于真正的钙化羟基磷灰石(HA)成分。P-RWV在这两项分析中均表现更好，在提到的频带中信号更强，显示的平均钙磷比(Ca/P)更接近正常人骨的值。P-RWV在第28天时实现了与人骨文献报道完全相同的C/P比值(≈0.23)。

6) 定量PCR分析及代谢活动。基因表达分析表明，P-RWV显示出Runx2的稳定表达，以及COL1A1、BGLAP、ALPL和SOST在最后7天培养中的上调。HARV具有类似的表达模式，但上调程度较轻。STAT表现为ALPL和COL1A1的稳定表达，以及Runx2、BGLAP和SOST在最后7天的上调。这些表达谱表明成功的骨源性分化，尤其是从诱导后第21天到第28天。代谢活动分析显示，三种系统中葡萄糖消耗动力学相似，表明持续的细胞生长。然而，在3D STAT中，由于初始浓度低，葡萄糖被迅速耗尽。

全文总结

本研究通过对比三种生物工艺(灌注系统、HARV、3D STAT)发现，灌注系统能有效减轻三维hDPSCs/海藻酸盐构建体外部的营养和氧气运输限制，促进hDPSCs的增殖、分化、矿化和成骨标志物表达，形成具有临床用途的三维骨样构建体。三种工艺的分化过程均得到证实。灌注系统在多数分析中表现更优，产生均质细胞构建体;STAT因质量传递限制产生异质性细胞构建体;HARV增殖缓慢，可能抑制了成骨细胞样细胞的正常分化。该灌注系统为hDPSCs在骨组织工程中的应用提供了一种高效、可扩展且易于操作的培养方案，有助于宏观骨形成。