利用微滴工程助力骨骼肌类器官高效再生

骨骼肌不仅是动物体内主要的执行器官，负责复杂的运动功能，还承担着重要的代谢功能，如在餐后状态下负责近80%的葡萄糖摄取。然而，许多骨骼肌疾病，如杜氏肌营养不良症、肌萎缩侧索硬化症和肌肉萎缩症等，目前仍缺乏有效的治疗手段。此外，尽管糖尿病与肌肉流失的关系已被广泛研究，但尚未开发出直接针对肌肉的治疗药物。横纹肌溶解症虽有临床治疗方案，但仍占急性肾衰竭病例的8%至15%。这些疾病的研究和治疗面临的一个关键挑战是缺乏可重复且生理相关的肌肉模型。

传统二维细胞模型难以复制复杂的三维微环境和基因表达谱，而现有的三维组织工程方法在表型重现和维持组织异质性方面仍面临挑战。此外，当前肌肉组织工程模型主要依赖手动或半自动化的基于柱状方法，限制了实验的高通量性，需要大量初始细胞，且与原代细胞的兼容性较差。尽管动物模型能有效解决许多科学问题，但在某些情况下实现准确的表型重现仍具挑战性。这些问题凸显了开发可靠、可重复、高通量体外模型的迫切需求，以更好地研究肌肉生物学、理解疾病机制和评估潜在疗法。

2025年5月15日，清华大学马少华团队发表在Research上题为Microdroplet-Engineered Skeletal Muscle Organoids from Primary Tissue Recapitulate Parental Physiology with High Reproducibility的研究开发了一种基于微滴工程技术的骨骼肌类器官(DEOs)，该类器官从原代组织中直接生成，无需原代细胞培养，显著缩短了骨骼肌类器官的生成时间至8天。通过级联管微流控技术，实现了从少量组织样本中批量生产数百个均匀的DEOs，提高了实验的可重复性和通量。DEOs不仅成功重现了骨骼肌的成熟结构，如条纹状肌节和肌肉纤维类型，还表现出自发和刺激性收缩功能，为骨骼肌疾病建模和药物筛选提供了一个高效、可靠的体外平台。

图示描述

1) 微滴工程化类器官的制备和发展。研究团队开发了两种不同的方法来生成原代骨骼肌类器官：手动移液的非工程化类器官(NEOs)和基于级联管微流控技术的微滴工程化类器官(DEOs)。两种方法都从小鼠腓肠肌组织开始，经机械和酶消化后，将原代骨骼肌细胞嵌入Matrigel中。NEOs是通过手动移液10μl的细胞载体Matrigel形成的，而DEOs则利用微流控系统生成约0.1μl(直径约500μm)的微滴类器官前体，随后3D打印到培养板中。单只雄性小鼠的腓肠肌可产生超过500个DEOs，足以装载五个96孔板用于药物筛选。从组织分离当天(D0)开始，类器官前体在骨骼肌增殖培养基中培养6天，然后转入分化培养基中培养2天，在D8形成成熟的骨骼肌类器官。

2) NEOs与DEOs的形态学和发展模式比较。NEOs展现出强烈的空间发展模式，起初为均匀的细胞密度分布，到D5时细胞聚集成多个小集落并形成集落间连接。到D7，出现了包括环状结构(稀疏-密集-稀疏细胞分布)在内的多种发展模式。10μl的NEOs呈现环状形态，具有明显的中央低细胞密度区域，而5μl的NEOs则在中心具有高细胞密度。相比之下，DEOs表现出更一致的大小分布，提高了结构均一性的可重现性，这对实现可重复的功能结果至关重要。尺寸分析显示，DEOs的大小分布明显更窄，而NEOs的变异性更大，这可能是由于手动移液过程中引入的不一致性。

3) 肌肉分化和肌纤维类型恢复。两种类器官都成功表达了关键肌肉标志物。DEOs在Myod1和Myog表达方面优于NEOs，表明其具有更强的早期肌源性分化能力。免疫荧光分析证实两种类器官都发展了成熟的肌纤维，但DEOs显示出更均匀的标志物分布。原生腓肠肌组织包含I型、IIA型和IIB型肌纤维，通过免疫荧光分析证实，NEOs和DEOs都成功重现了这些肌球蛋白同种型的表达模式。此外，两种类器官都表现出清晰的横纹形态结构，类似于亲本组织，表明肌节结构的成功重建。然而，类器官未展现出成熟组织中观察到的组织化基底膜结构或周边核定位，这可能是由于培养系统中缺乏单轴生物力学刺激所致。

4) DEOs在组织重现方面的优势。RNA测序分析揭示DEOs在基因表达上与亲本组织相比具有更高的相关性。DEOs展现出增强的再生基因表达谱，包括更高水平的Pax7、Myod1、Myf5和Myog。DEOs还表现出更低水平的抑制性肌细胞因子myostatin(Mstn)和更高水平的支持性肌细胞因子Fgf21和Igf1，表明有利于肌肉生长和再生的调节环境。相较于NEOs，DEOs表现出细胞间通讯基因的上调，如细胞黏附和连接相关基因Cdh2和Cdh15，对肌母细胞融合和细胞间连接至关重要。此外，DEOs还显示出成纤维细胞活化和增殖的下调，这可能是其优于NEOs的关键机制之一。

5) 类器官的电刺激和功能分析。为评估类器官的功能，研究团队设计了专门的电刺激板，允许实时多通道刺激和观察。与NEOs相比，DEOs表现出更一致的收缩模式。在电刺激下，DEOs表现出稳健的功能性，能够响应外部电刺激并表现出随频率增加而逐渐下降的峰值收缩幅度。此外，DEOs还表现出骨骼肌的关键功能特性，包括波浪叠加和强直收缩。在4Hz的频率下，DEOs的归一化收缩峰值振幅随时间增加，表明时间叠加的发生。在10Hz刺激下，观察到强直收缩。类器官还表现出疲劳特性，随着持续刺激，收缩峰值振幅逐渐下降，这一趋势在1Hz至5Hz的刺激频率范围内一致观察到。此外，DEOs还对乙酰胆碱(Ach)治疗表现出适当的反应，在4μM浓度时峰值振幅显著增加，5μM时转变为强直收缩。

6) 骨骼肌DEOs作为药理反应和代谢病理模型。为评估DEOs作为生理相关模型的实用性，研究进行了概念验证实验。使用心肌毒素(一种来自蛇毒的肌溶解肽)治疗24小时，在不低于1μM的浓度下导致显著的ATP耗竭，表现出浓度依赖性细胞毒性效应。丹曲洛尔(一种抑制钙释放的药物)导致收缩振幅的渐进性衰减，在1μM时表现为部分抑制，5μM时完全停止。洗脱15分钟后观察到部分功能恢复。辛伐他汀(一种与临床横纹肌溶解症相关的他汀类药物)诱导浓度依赖性的细胞活力下降。此外，研究还建立了高血糖模型，在高血糖条件下培养的DEOs表现出葡萄糖摄取减少、LDH释放增加和自噬体积累，模拟了体内高血糖状态下受损的葡萄糖利用。

全文总结

这项研究开发的微滴工程化骨骼肌类器官具有多方面的重要意义。首先，该方法大大缩短了培养周期至8天，简化了整体程序，无需任何原代培养即可通过2步发展过程直接从组织分离的原代细胞中发展类器官。其次，DEOs展现出高度成熟性和功能性，包括良好发育的横纹肌节结构、自发和刺激诱导的收缩，以及亲本肌纤维类型的重现。第三，级联管微流控平台能够从小块组织样本中高通量产生数百个均匀的DEO重复品，为骨骼肌研究和药物筛选提供了可扩展且可重复的解决方案。此外，这一平台还成功应用于药物反应和代谢疾病的模型研究，为未来的疾病建模和药物开发提供了有价值的工具。总体而言，这一研究通过提供更快、更一致、更相关的骨骼肌体外模型，有望加速肌肉生物学研究、疾病机制理解以及新疗法的发现。