视黄酸促进结膜上皮分化和杯状细胞再生

结膜上皮是覆盖巩膜和内眼睑的特化组织，作为眼表的保护屏障，对防御机械损伤、病原体和干燥至关重要。结膜上皮由不同类型细胞组成，包括角质形成细胞和杯状细胞，它们协同维持眼表的稳态。角质形成细胞形成上皮的结构基础，提供物理屏障，而杯状细胞则负责分泌凝胶形成的黏蛋白，尤其是MUC5AC，帮助保持眼表湿润和受保护。

维生素A及其衍生物在各种生物过程中的重要性已得到充分证实，包括维持呼吸道和消化道，以及胚胎发育。众多研究表明，维生素A是眼表健康的关键营养素，在维持结膜和角膜上皮的完整性和功能方面发挥着重要作用。然而，虽然视黄酸(维生素A的活性代谢物)已被证明能促进体外结膜上皮细胞的分化，但关于其对体内杯状细胞的生物学效应的证据仍然有限。

结膜杯状细胞的数量是评估干眼治疗效果的关键指标。然而，目前大多数干眼治疗研究都是使用组织切片来评估杯状细胞数量。考虑到杯状细胞在结膜上分布不均，仅依靠组织切片可能无法准确代表杯状细胞总体变化。虽然一些研究使用全视野免疫荧光染色MUC5AC和其他蛋白来评估杯状细胞分布，但这种方法既耗时又费力，在效率方面存在局限性。

近期，吉林大学中日联谊医院眼科视光中心王淑荣/厦门大学眼科研究所李程在The Ocular Surface期刊发布了题为Retinoic acid promotes conjunctival epithelium differentiation and goblet cell regeneration: evidence from novel 3D conjunctival organoids and whole-mount PAS staining的文章，研究团队开发了一种创新的结膜全视野PAS染色方法，可以清晰观察杯状细胞分布。通过这种新的评估技术，结合之前建立的结膜损伤模型，研究者首次证明视黄酸能促进结膜上皮修复和杯状细胞再生。

图示描述

1) 视黄酸促进2D培养条件下结膜上皮分化：研究团队首先基于已发表的工作建立了2D原代结膜上皮培养模型。当细胞融合度达到80%-90%时，加入视黄酸诱导分化。结果显示，对照组展现出典型的鹅卵石形态，而视黄酸处理组失去了这种特征性上皮形态，细胞边界变得不明显，形成融合单层。定量PCR分析表明，干性相关标志物(K14、Ki67和P63)随时间逐渐下降，而分化标志物Runx2表达增加。此外，杯状细胞标志物K7和杯状细胞分化转录因子Foxa1在视黄酸组中显著增加。免疫荧光和Western blot分析进一步证实了K7表达的显著增加，以及干性标志物的下降。这些结果表明视黄酸可以促进结膜上皮细胞向杯状细胞分化。

图1 在二维条件下加入维甲酸对mConj-epi分化能力的评价

图2 ATAR诱导后2d培养结膜上皮细胞的蛋白表达分析

图3 ATRA诱导后不同时间点结膜上皮标志物的变化

2) 建立新型3D结膜类器官模型：研究者开发了小鼠结膜类器官，使用不同于之前发表的培养基配方。在2C培养基(含Y-27632和SB431542)中，小鼠结膜类器官中央区域形成空心结构，HE染色进一步证实了空心类器官的形成。为证实结膜类器官包含不同的细胞类型，研究者分析了2C培养的结膜类器官中的结膜标志物，包括K14、K19、K13和Aqp5。重要的是，由于类器官外层细胞直接接触Matrigel，这些细胞对应于体内的基底层细胞，而内层细胞代表正常结膜组织的分化细胞。各种标志物在类器官中的表达模式与正常结膜组织非常相似，表明该模型能有效模拟体内结膜上皮的特性。

图4 结膜类器官模型的建立与验证

3) 视黄酸促进小鼠结膜类器官模型中杯状细胞分化：诱导48小时后，将类器官切片并染色。PAS染色显示视黄酸诱导的类器官中心区域存在明显的PAS阳性物质累积。双免疫荧光染色显示，视黄酸诱导的类器官中心区域Muc5ac阳性染色显著增加，同时K7表达明显上调。相比之下，对照组类器官在中心区域仅显示最小的Muc5ac染色。定量分析也证实视黄酸处理显著增加了Muc5ac阳性类器官的数量。定量PCR分析表明，与2D培养相似，干性标志物(K14、Ki67、P63和K17)表达显著降低，而杯状细胞标志物(Muc5ac、Gcnt3、Tff1和K7)表达显著增加。此外，杯状细胞的分化标志物Foxa1和Spdef也显著升高。这些结果表明视黄酸减少结膜类器官增殖能力并促进杯状细胞分化。

图5 利用新型3D小鼠结膜类器官模型研究视黄酸的分化作用

4) 开发评估结膜杯状细胞的新方法：结膜PAS全视野染色：在之前的研究中，杯状细胞数量通常使用组织切片进行评估。然而，由于杯状细胞在结膜上分布不均，且常规切片厚度通常小于10μm，这种方法难以准确反映整个结膜的杯状细胞总数。为解决这一限制，研究者开发了一种使用结膜PAS全视野染色评估结膜杯状细胞的新方法。通过仔细操作小鼠结膜，去除多余组织(包括结膜下筋膜、睑板腺和肌肉)，然后对平展的组织进行PAS染色，使整个结膜可见。基于解剖结构和杯状细胞分布，研究者将小鼠结膜分为三个区域：睑部结膜、穹窿结膜和球部结膜。定量分析显示，穹窿结膜中杯状细胞数量和密度最高，睑部结膜杯状细胞较少，而球部结膜几乎没有杯状细胞，这与之前的研究一致。

图6 新型结膜全染PAS染色的建立

5) 视黄酸促进体内结膜上皮再生：利用之前建立的结膜上皮损伤模型，研究者首次证明视黄酸可以促进体内结膜杯状细胞的修复。首先，通过HE染色确认该模型能成功去除结膜上皮。组织学分析显示，损伤后第一天结膜上皮开始再生，形成新的上皮层，但这种新形成的上皮由单层较大的细胞组成，与正常结膜上皮有显著差异。经过每日四次视黄酸滴眼液治疗，全视野结膜染色结果显示，与对照组相比，治疗组在第二天结膜血管显著减少，表明视黄酸可能通过促进上皮增殖和减少炎症来促进早期损伤阶段的结膜上皮修复。到第四天，治疗组出现了杯状细胞，而对照组几乎没有检测到。第六天，两组都出现了较小的杯状细胞，但治疗组杯状细胞数量更多，分布更广。最终，在第八天，杯状细胞几乎分布在整个结膜，尽管其形态仍与正常结膜杯状细胞有明显差异。在4、6和8天时，视黄酸组杯状细胞密度恢复显著快于对照组，两组间有统计学差异。

图7 视黄酸促进结膜修复和杯状再生

6) 视黄酸的作用机制初步探索：研究者推测视黄酸通过RAR受体发挥其作用，因为在角膜和结膜组织中只表达RARα、RARγ和RXRα。其中，只有RAR可以结合全反式视黄酸，表明其可能在介导观察到的效应中发挥作用。为研究视黄酸对结膜上皮的影响是否通过RARα介导，研究者使用了BMS-753(一种选择性RARα激动剂)。结果表明，BMS-753处理后，2D条件下培养的结膜上皮细胞表现出部分形态学变化。此外，定量PCR分析证实BMS-753可以部分模拟视黄酸的效应。这些发现表明视黄酸至少部分通过RARα发挥作用;然而，涉及的具体下游通路需要进一步研究。

全文总结

本研究全面展示了视黄酸在促进结膜上皮分化和杯状细胞再生方面的作用，包括体外和体内证据。研究者开发了具有广阔应用前景的新型结膜类器官模型，这种模型使用简化的培养基配方，成功模拟了体内结膜上皮的特性。此外，还建立了更准确评估杯状细胞分布的结膜PAS全视野染色新方法。这些发现对理解视黄酸在眼表健康中的作用提供了新见解，也为干眼症等结膜疾病的治疗开辟了新途径。视黄酸促进杯状细胞再生的能力可能对治疗维生素A缺乏导致的眼表疾病特别有价值。此外，新开发的结膜类器官模型和杯状细胞评估方法为未来研究提供了有价值的工具。综上所述，本研究不仅增进了对视黄酸在结膜生物学中作用的理解，还提供了新的实验模型和评估方法，为结膜相关疾病的未来研究奠定了基础。