蜱传脑炎病毒现场快检！生物发光 + 冻干试剂，30 分钟出结果

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Designing the homogeneous competitive bioluminescence‑based assay for tick‑borne encephalitis virus (TBEV) point‑of‑care detection

中文标题：基于均相竞争性生物发光法的蜱传脑炎病毒(TBEV)现场检测方法设计

发表期刊：《Analytical and Bioanalytical Chemistry》

影响因子：3.8

作者单位：

1 Institute of Biophysics, Federal Research Center “Krasnoyarsk Science Center SB RAS”, Akademgorodok 50/50, 660036 Krasnoyarsk, Russia

作者信息：

Alexander N. Kudryavtsev¹, Eugenia E. Denisova¹, Vasilisa V. Krasitskaya¹

研究背景

蜱传脑炎病毒(TBEV)是致神经系统严重损伤的高致病性蜱传黄病毒，主要通过硬蜱传播，俄罗斯每年报告数千病例，2022 年蜱叮咬求助量超 50 万例。疫苗是主要防护手段，但欧洲(约 25%)和俄罗斯(<10%)接种率低，未接种者被蜱叮咬后需被动免疫(抗 TBEV IgG)，却存在生物风险且常不推荐。现有实验室检测方法(免疫分析、PCR)虽能检测蜱中病毒以避免不必要免疫，但无法现场使用;因此，本研究开发 “混合即读”(mix-and-read)型均相竞争性生物发光检测法 —— 将拆分的 NanoLuc 荧光素酶片段(N 端 NLucL，17.6 kDa;C 端 NLucS，11 个氨基酸)分别与 TBEV 的 prED3 抗原(E 蛋白 D3 结构域)或抗 TBEV 单链抗体 sc14D5a 融合，通过抗原 - 抗体互作使酶片段互补恢复发光，样本中 TBEV 会竞争结合抗体导致发光信号下降，同时开发冻干即用型试剂，适配现场检测需求。

研究方法

以大肠杆菌 Rosetta-gami 2 为表达宿主，构建 8 种融合蛋白质粒(sc14D5a 或 prED3 分别与 NLucL/NLucS 的 N 端 / C 端融合，含 His₆标签和 (G₂S)₅柔性 linker)，测序验证后经 0.5 mM IPTG 诱导表达(23℃培养 20 h);抗体融合蛋白从胞质提取，抗原融合蛋白从包涵体(6 M 尿素溶解)复性后，均通过 HisTrap HP 柱亲和层析 + 凝胶过滤纯化;检测融合蛋白性质：测 furimazine 依赖的生物发光活性，通过竞争固相免疫分析验证 Ab-NLucS 与 prED3 的结合能力，固相结合实验检测 Ag-NLucL 与抗 TBEV 抗体 14D5 的亲和力;均相竞争性检测中，将 Ag-NLucL 与 Ab-NLucS 混合物(0.1 μM 各)分别与 prED3(0.2-16 μg/mL)、灭活 TBEV 疫苗(效价 1:10-1:200)或天然蜱提取物(乙醇清洗 - 研磨 - 离心上清)共孵育 30 min，测发光信号，以 L/L₀(样本信号 / 阴性对照信号)为区分因子 D;制备冻干即用型试剂：将融合蛋白混合物(含 / 不含 prED3)与 furimazine 冻干，检测 5℃/-20℃储存 0-3 个月后的发光稳定性及对疫苗的检测效果，统计用 Mann-Whitney U 检验(p<0.05 为显著)。

实验结果

图1：拆分 NanoLuc 片段与 sc14D5a/prED3 融合蛋白的生物发光互补效果

将 8 种融合蛋白按 “抗体融合蛋白 + 抗原融合蛋白” 组合制成等摩尔混合物(100 nM 各)，测 furimazine 依赖的生物发光(相对光单位 r.l.u.);结果显示，14D5a-NLucS(抗体 - C 端片段)+ prED3-NLucL(抗原 - N 端片段)组合的发光信号最强，其他组合(如 NLucL-14D5a+prED3-NLucS 等)发光强度仅为该组合的 10%-30%，证实该组合中酶片段的空间取向最利于互补，为后续实验的最优融合对。

图2：最优融合对(14D5a-NLucS+prED3-NLucL)的关键特性

A 图显示，该融合对的蛋白归一化发光强度为完整 NanoLuc 的 2.4%，冻干后(-20℃储存 6 个月)发光强度无显著下降，且发光动力学与完整 NanoLuc 一致;

B 图通过竞争固相免疫分析证实，Ab-NLucS 与 prED3 的亲和常数接近游离 sc14D5a 的亲和常数;

C 图固相结合实验显示，Ag-NLucL 可与抗 TBEV 抗体 14D5 特异性结合，且结合量随抗体浓度升高而增加，证实融合蛋白保留抗原 - 抗体结合活性。

图3：TBEV 相关靶标的均相竞争性检测结果

A 图检测 prED3(0.2-16 μg/mL)时，发光信号随浓度升高而下降，拟合曲线 R²=0.998，检测限为 0.3 ng(相当于约 10⁸个病毒颗粒，符合蜱中 TBEV 载量 10⁷-10¹⁰个 / 蜱的临床需求);B 图检测灭活 TBEV 疫苗(效价 1:10-1:200)时，效价 1:200 仍可检出(低于制造商标注的工作效价 1:128);C 图检测 79 份 TBEV 阴性蜱和 7 份阳性蜱提取物，阴性组 L/L₀中位数为 1.0(四分位距 0.93-1.2)，阳性组为 0.56(0.53-0.65)，两组差异极显著(p=0.000013)，当 D<0.65 时可判定为 TBEV 阳性，与商用固相 ELISA 结果无差异。

图4：冻干即用型试剂的稳定性与检测效果

A 图显示，冻干试剂 I(Ag-NLucL+Ab-NLucS)和 II(I+prED3)加水复溶后，II 组发光强度始终为 I 组的 25%-30%，证实 prED3 的竞争作用稳定;B 图显示，含 furimazine 的冻干试剂 III(I+furimazine)和 IV(II+furimazine)复溶后，30 min 内发光信号仍为初始的 80% 以上，可作为阴性对照 C⁻(III)和阳性对照 C⁺(IV);C 图显示，C⁻与 C⁺在 5℃/-20℃储存 3 个月后，发光强度虽下降 5-7 倍，但 L/L₀仍稳定，证实试剂稳定性良好。

研究结论

本研究成功开发基于拆分 NanoLuc 互补的 TBEV 均相竞争性生物发光检测法：最优融合对 14D5a-NLucS+prED3-NLucL 的发光互补效率达完整 NanoLuc 的 2.4%，可检出 0.3 ng prED3(10⁸病毒颗粒)、效价 1:200 的灭活疫苗，能准确区分天然感染与未感染蜱(p=0.000013)，且与商用 ELISA 结果一致;冻干即用型试剂(含 C⁻/C⁺对照)在 5℃/-20℃储存 3 个月，区分因子稳定，无需复杂操作即可 “混合即读”。该方法填补了 TBEV 现场检测的技术空白，可作为便携式检测设备的生化模块，为蜱叮咬后快速判断是否需免疫干预提供可靠工具，也为其他蜱传病毒的现场检测提供参考。