非侵入性测线粒体功能！颊细胞呼吸测量方案出炉，助力代谢研究

线粒体呼吸测量是评估电子传递链氧消耗的重要手段，但针对非侵入性样本的检测方法仍有限。来自加拿大卡尔加里大学的 团队在《STAR Protocols》(2025, 6:104004)发表研究，建立了一套从颊拭子样本中测量线粒体呼吸能力的完整方案：包括颊细胞收集、原代培养、呼吸计校准、细胞悬浮、计数及氧消耗测量。该方案通过非侵入性取样，适用于儿科等敏感群体，为代谢研究提供了可靠的线粒体功能评估工具。

本研究旨在建立标准化的颊细胞线粒体呼吸测量流程，以非侵入性方式评估线粒体功能。核心步骤包括：用无菌拭子收集颊细胞，立即置于 MiR05 缓冲液中;经冷冻 / 解冻、过滤、离心后进行原代培养(4-7 天，至 80% 汇合);使用 Oxygraph-2K 呼吸计校准后，测量细胞悬浮液的氧消耗率;通过细胞计数标准化数据。该方案可稳定检测线粒体复合物活性，尤其适合难以获取侵入性样本的研究(如儿科)。

研究背景

线粒体呼吸功能是代谢状态的关键指标，但其测量多依赖侵入性样本(如肌肉活检)，限制了在敏感群体(如儿童)中的应用。颊细胞作为非侵入性样本，易获取且伦理争议小，但现有方法缺乏标准化的培养和呼吸测量流程。

本研究针对这一局限，优化了颊细胞的收集、培养及线粒体呼吸测量步骤，首次建立了从颊拭子到线粒体呼吸评估的完整方案，填补了非侵入性样本线粒体功能检测的方法学空白，为代谢相关疾病研究提供了实用工具。

实验结果

图 1：颊细胞呼吸测量的工作流程示意图

该图展示实验全流程：从颊细胞收集开始，经冷冻保存、过滤、离心、解冻后进行原代培养;培养后的细胞经胰酶消化获得悬浮液，计数后用于 Oxygraph-2K 呼吸计测量氧消耗。流程清晰呈现了从样本收集到数据获取的关键步骤，强调非侵入性和可操作性。

图 2：样本制备概述

该图显示颊细胞收集与初步处理步骤：用无菌拭子擦拭颊内侧 10 秒，立即浸入 MiR05 缓冲液，涡旋洗脱细胞;样本经过滤(去除杂质)、离心后可直接培养或冷冻(含 10% DMSO 长期保存)。步骤设计注重细胞活力保留，为后续培养和呼吸测量奠定基础。

图 3：颊细胞形态与健康状态的台盼蓝染色成像

该图通过台盼蓝染色显示颊细胞的形态差异：(A) 健康颊细胞呈圆形或椭圆形，形态规则，台盼蓝染色阴性;(B) 不健康细胞表现为皱缩、形态不规则，且台盼蓝渗透显著增加。该结果为细胞活力评估提供了形态学依据，帮助区分活细胞与死细胞，确保后续实验使用健康细胞。

图 4：呼吸计结构示意图

该图展示了 Oxygraph-2K 呼吸计的核心结构，包括用于底物 / 抑制剂滴定的微量注射器、密封塞(stopper)、样品室(Sample Chamber)和氧传感电极(Oxygen Sensing Electrode)。结构示意图明确了呼吸测量的关键组件，为呼吸计校准和氧消耗测量的操作提供了直观参考。

图 5：自动细胞计数仪结合台盼蓝染色的细胞计数流程

该图呈现细胞计数的关键步骤：悬浮细胞 aliquots 与台盼蓝按 1:1 混合，将混合物加载到计数盘，通过自动细胞计数仪读取结果，最终获得细胞计数数据(均值 ± 标准差，n=3)。该流程确保了活细胞定量的准确性，是后续呼吸数据标准化的基础。

图 6：细胞活力与计数数据

该图展示了细胞活力和计数的量化结果，包括总细胞、活细胞、死细胞的数量及百分比分布，数据以均值 ± 标准差表示(n=3)。结果验证了颊细胞在培养和处理后的活力状态，为线粒体呼吸测量的可靠性提供了细胞层面的支持。

图 7：颊细胞培养悬浮液的线粒体呼吸典型轨迹

该图为颊细胞线粒体呼吸的代表性曲线，显示不同时间点的氧消耗率变化(单位为 pmol・s⁻¹・mL⁻¹)，体现了线粒体在底物和抑制剂作用下的呼吸动态过程，直观反映了线粒体呼吸功能的稳定性。

图 8：线粒体生物能量学数据

该图量化了线粒体的不同呼吸状态，包括复合物 I 磷酸化呼吸(CIp)、复合物 I 质子泄漏(CI Lp)、复合物 I+II 磷酸化呼吸(CI+CIIp)及电子传递链最大呼吸(ETS)，数据以均值 ± 标准差表示(n=3)。结果明确了各呼吸链复合物的活性，为线粒体功能评估提供了量化指标。

研究结论

本研究成功建立了从颊拭子样本测量线粒体呼吸能力的标准化方案：通过非侵入性收集颊细胞，经原代培养(4-7 天)后，利用 Oxygraph-2K 呼吸计测量氧消耗率，结合细胞计数实现数据标准化。该方案可稳定评估线粒体复合物活性及最大呼吸能力，尤其适合难以获取侵入性样本的研究(如儿科代谢疾病)，为线粒体功能相关的代谢研究提供了可靠、实用的工具。