THP-G1b 细胞系：精准预测皮肤致敏物质的新工具

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：The IL‑1β promoter‑driven luciferase reporter cell line THP‑G1b can efficiently predict skin‑sensitising chemicals

中文标题：IL-1β 启动子驱动的荧光素酶报告细胞系 THP-G1b 可高效预测皮肤致敏化学物质

发表期刊：《Archives of Toxicology》

影响因子：6.9

作者单位：

Department of Dermatology, Tohoku University Graduate School of Medicine, 1‑1, Seiryo‑machi, Aobaku, Sendai 980‑8574, Japan

作者信息：

Hitoshi Terui, Yutaka Kimura, Chizu Fujimura

研究背景

IL-1 作为过敏性接触性皮炎(ACD)致敏的关键促炎介质，既往研究存在明显局限：多采用小鼠 ACD 模型或小鼠树突状细胞(DC)，且仅测试少数半抗原(如 TNCB、DNFB)，无法明确多数非小鼠模型常用半抗原诱导人类 ACD 时是否产生 IL-1α/β，也不清楚人类 DC 在多数半抗原刺激下是否分泌 IL-1α/β;同时，现有体外皮肤致敏测试(如 h-CLAT、U-SENS™)多基于 DC 表面分子(CD54/CD86)，IL-1α/β 作为预测标志物的结果一致性差。为此，本研究先验证 10 种半抗原(3 种极端、1 种强、3 种中等、3 种弱致敏)对人单核细胞系 THP-1(常用 DC 替代细胞)IL-1α/β mRNA 表达的影响，再构建 IL-1β 启动子驱动的荧光素酶报告细胞系 THP-G1b，通过检测 IL-1β 启动子活性评估其对 88 种半抗原和 34 种非半抗原的预测能力，填补人类 DC-IL-1 应答与皮肤致敏预测的研究空白。

研究方法

1.THP-G1b 报告细胞系构建与关键参数定义

从人单核细胞系 THP-1 衍生构建 THP-G1b 细胞系，该细胞稳定整合两种荧光素酶基因：①SLG(稳定绿色荧光素酶)，由 IL-1β 启动子调控，其活性记为 IL1LA(反映 IL-1β 转录活性);②SLR(稳定红色荧光素酶)，由 GAPDH 启动子调控，其活性记为 GAPLA(作为内参校正细胞活力差异)。定义核心评估参数：nIL1LA(IL1LA 与 GAPLA 的比值，消除细胞活力对检测结果的干扰)、Ind-IL1LA(化学物质处理组 nIL1LA 与未处理组 nIL1LA 的比值，量化 IL-1β 启动子激活倍数)、Inh-GAPLA(处理组 GAPLA 与未处理组 GAPLA 的比值，评估细胞毒性)。

2.测试化学物质与溶解策略

测试 122 种化合物，包括 88 种半抗原(依据局部淋巴结试验 LLNA 分类：9 种极端致敏、17 种强致敏、34 种中等致敏、28 种弱致敏)和 34 种非半抗原(如 SLS、乳酸等刺激物)。采用差异化溶解方法：水溶性化合物直接用 X-VIVO™15(无血清培养基)溶解，浓度为 20mg/mL;水不溶性化合物分别用两种溶剂处理：①DMSO(起始浓度 500mg/mL，2 倍梯度稀释);②X-VIVO™15(20mg/mL 浓度，经涡旋振荡、15000rpm 离心 5 分钟取上清)，最终确保培养基中 DMSO 浓度≤0.1%，避免溶剂自身的细胞毒性干扰。

3.分子水平检测与致敏性判断标准

分子表达检测：通过 qPCR(采用 ΔΔCt 法，以 GAPDH 为内参)检测 THP-1 细胞中 IL-1α/β mRNA 的相对表达量;通过 ELISA 试剂盒检测 THP-1 细胞培养上清中 IL-1α/β 蛋白的分泌浓度。

报告活性检测：使用 Phelios 多色检测系统，定量测定 THP-G1b 细胞中 SLG(IL1LA)和 SLR(GAPLA)的荧光素酶活性，计算 Ind-IL1LA。

致敏性判断：单次实验中，若 Ind-IL1LA≥1.4 且 95% 置信区间下限≥1.0，判定为 “阳性”;4 次重复实验中，2 次阳性则定义为 “致敏剂”，3 次阴性则定义为 “暂定非致敏剂”。改良版 assay(moIL-1 Luc)额外结合 Inh-GAPLA(<0.8 提示细胞对化合物暴露充分)，减少 “不确定” 结果，提升特异性。

4.assay 性能评估

以 LLNA 结果为参考标准，计算 assay 的核心性能指标：准确率(正确判断化合物致敏性的比例)、平衡准确率((灵敏度 + 特异性)/2，综合评估正负样本识别能力)、灵敏度(正确识别致敏剂的比例)、特异性(正确识别非致敏剂的比例)，对比 IL-1 Luc assay 与传统 IL-8 Luc assay(OECD TG442E)的性能差异。

实验结果

图1：半抗原与刺激物对 THP-1 细胞 IL-1α/β mRNA 表达的影响

A 图(IL-1α mRNA)、B 图(IL-1β mRNA)显示，除半抗原 MDGN 外，3 种极端致敏(恶唑酮、4-NBB、DNCB)、1 种强致敏(MDGN 除外)、3 种中等致敏(乙二醛、2-MBT、肉桂醛)、3 种弱致敏(TMTD、丁子香酚、肉桂醇)半抗原，均能使 THP-1 细胞的 IL-1α/β mRNA 表达量上调≥4 倍(P<0.05);3 种刺激物(水杨酸、乳酸、SLS)中，仅 SLS 轻微上调 IL-1α mRNA(<4 倍)，水杨酸、乳酸对 IL-1α/β mRNA 无显著影响。若以 “IL-1β mRNA 上调≥2 倍” 为判断阈值，可 100% 区分半抗原(除 MDGN)与刺激物。结果证实多数半抗原可诱导人类单核细胞系 THP-1 产生 IL-1α/β mRNA 应答，为 THP-G1b 细胞系的构建与应用提供理论依据。

图2：溶剂对 THP-G1b 细胞 Ind-IL1LA 的影响

对比 DMSO 与 X-VIVO™15 作为溶剂时，10 种半抗原和 3 种刺激物对 THP-G1b 细胞 Ind-IL1LA 的诱导效果。结果显示，半抗原在 X-VIVO™15 中诱导的 Ind-IL1LA 显著高于 DMSO(如恶唑酮：X-VIVO™15 组 Ind-IL1LA≈9，DMSO 组≈2);而刺激物在两种溶剂中，Ind-IL1LA 均 <1.4(未达阳性阈值)。所有半抗原均被 THP-G1b 判为 “阳性”，刺激物均判为 “阴性”。结果确定 X-VIVO™15 为最优溶剂，可增强水不溶性半抗原的诱导活性，且 THP-G1b 细胞能有效区分半抗原与刺激物。

研究结论

本研究证实，多数半抗原(无论致敏强度)可诱导人 THP-1 细胞表达 IL-1α/β mRNA，仅极端和强致敏半抗原能诱导少量 IL-1β 蛋白分泌;构建的 THP-G1b 细胞系通过检测 IL-1β 启动子活性，在应用适用性域(排除酸酐、洗涤剂等特殊化合物)后，IL-1 Luc assay 的平衡准确率达 80.3%、灵敏度 94.0%、特异性 66.7%，性能优于传统 IL-8 Luc assay(OECD TG442E)。改良的 moIL-1 Luc assay 结合 Inh-GAPLA 后，特异性可提升至 82.6%，且 “不确定” 结果从 35 个减少至 14 个;将 moIL-1 Luc 与 moIL-8 Luc assay 联合采用 “2 out of 2” 策略(两种 assay 均判为阳性才定义为致敏剂)，对人类致敏潜力的阳性预测值达 100%。综上，THP-G1b 细胞系是高效的皮肤致敏预测工具，同时为皮肤致敏不良结局路径(AOP)中 “DC 激活” 关键事件提供了人类细胞层面的实验证据。