胎鼠肺近端祖细胞分化气道类器官的培养与表征

气道上皮是呼吸系统的第一道机械屏障，在损伤后维持组织稳态发挥重要作用。气道上皮由分泌性杯状细胞、终末分化的纤毛细胞、基底干细胞以及少数杯状细胞、神经内分泌细胞和离子细胞组成。在胚胎肺发育过程中，所有类型的近端气道上皮细胞均来源于Sox2+祖细胞的分化。早期胚胎气道上皮发育缺陷常与新生儿死亡率相关，同时也与成年期多种危及生命的肺部疾病有关，包括支气管肺发育不良、慢性阻塞性肺疾病和肺癌等。

近年来，体外3D培养技术的进步使得从干细胞或祖细胞衍生的类器官成为可能，这些类器官在功能和形态上能够近生理水平地模拟气道上皮。这种方法使研究人员能够阐明肺发育的分子机制以及与各种呼吸系统疾病相关的遗传改变的后果。此外，多个研究小组已开发出肺类器官疾病模型用于临床前药物筛选。建立生理相关的呼吸上皮体外模型对于理解肺发育和呼吸系统疾病至关重要，但目前仍缺乏标准化的、可重现的方法来建立功能性气道类器官模型。

近期，安徽大学健康科学与技术研究所李秋伶等在Bio-Protocol期刊上发表了题为Culture and Characterization of Differentiated Airway Organoids from Fetal Mouse Lung Proximal Progenitors的研究论文，该研究建立了一种基于E13.5小鼠近端上皮祖细胞的3D气道类器官培养体系，可高效模拟气道上皮分化过程，为研究肺发育、上皮细胞命运决定及呼吸系统疾病提供重要的体外模型。

图示描述

1，胎鼠近端气道祖细胞的分离与纯化：研究建立了从E13.5胎鼠中分离近端气道祖细胞的标准化流程。首先通过交配获得E13.5妊娠小鼠，在无菌条件下解剖胚胎，精确分离气管和肺组织。分离过程需要在体视显微镜下进行，使用精细镊子清除气管周围的结缔组织，并纵向切开气管以便后续处理。分离得到的气管组织用缓冲液清洗三次以去除多余的结缔组织，然后置入含有Pronase消化液的离心管中，在4°C下过夜消化约14小时。消化后的组织经过机械分离和过滤，最终获得纯化的近端气道祖细胞悬液，细胞计数控制在每100μL悬液中含800个细胞。

2，3D气道类器官的体外培养体系建立：建立了基于Matrigel的3D培养体系来培养气道类器官。将预冷的Matrigel在24孔板底部铺设100μL并在37°C孵育30分钟使其聚合。将纯化的祖细胞悬浮在mTEC/Plus2培养基中，然后与Matrigel按1:1比例混合，接种到Matrigel包被的培养板中，确保细胞在3D液滴形状的Matrigel中生长。类器官在5% CO2、37°C条件下培养18天，每两天更换一半培养基。从培养第2天开始，祖细胞开始形成管腔样结构，随着培养时间延长逐渐发育成具有中空球形结构的气道类器官。整个培养过程中定期拍照记录类器官的形态变化，观察其从小的聚集体逐步发育为复杂的管腔结构。

图1 实验流程示意图

3，类器官的细胞组成与分化标志物表征：通过免疫荧光染色技术对培养18天的气道类器官进行了详细的细胞学表征。结果显示类器官具有多层细胞结构，成功重现了体内气道上皮的细胞组成特征。在管腔侧表达终末分化纤毛细胞特异性标志物乙酰化α-微管蛋白(Ac-tubulin)，表明类器官中存在功能性纤毛细胞。在外周侧表达基底细胞特异性标志物Tp63和Krt5，证实了基底干细胞的存在和正确定位。这种细胞组织方式与体内气道上皮的分层结构高度一致，其中纤毛细胞位于管腔表面负责纤毛运动，基底细胞位于基底膜附近作为干细胞库维持上皮更新。DAPI核染色显示了细胞核的清晰分布，进一步确认了类器官的多细胞结构特征。

4，培养体系的优化与标准化：研究建立了完整的培养基配方体系，包括mTEC/basic、mTEC/Plus1和mTEC/Plus2三种不同成分的培养基，以满足细胞分离、维持和分化的不同需求。mTEC/Plus2培养基含有多种生长因子和信号分子，包括EGF、胰岛素、转铁蛋白、胆霉毒素、视黄酸、Y-27632、CHIR99021、A8301和Noggin等，这些成分协同作用促进祖细胞的增殖和向不同细胞类型的分化。研究还优化了Matrigel的使用条件，强调必须在冰上操作以防止提前聚合，并建立了严格的质量控制标准。此外，制定了详细的故障排除指南，包括细胞分离效率低、筛网堵塞、类器官形成失败等常见问题的解决方案，确保实验的可重现性和成功率。

图 2 小鼠肺近端祖细胞分化的气道类器官 3D 培养俯视图

全文总结

该研究建立的胎鼠肺近端祖细胞气道类器官培养体系为肺发育和呼吸系统疾病研究提供了重要的体外模型工具。该体系能够有效重现体内气道上皮的细胞组成和空间结构，为研究气道发育的分子机制、上皮细胞命运决定以及疾病发病机理提供了理想的实验平台。与传统的气液界面培养方法相比，该3D培养体系所需祖细胞数量更少，形成的类器官更适合用于体内移植和疾病研究。此模型可用于探索早期肺发育的分子机制和相关呼吸系统疾病的发病机理，为建立体外肺发育不良疾病模型提供了重要工具，具有广阔的临床前药物筛选和疾病机制研究应用前景。